Fundamentos de la Espectrofotometría: Principios de Absorción y Medición de Concentración
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Introducción a la Espectrofotometría
La Espectrofotometría es un método instrumental analítico que sirve para cuantificar y caracterizar un compuesto en solución. Se fundamenta en la capacidad de átomos y moléculas de absorber y emitir energía dentro del espectro electromagnético.
El Espectro Electromagnético y la Longitud de Onda
El espectro electromagnético debe visualizarse en términos de unidades de energía y, por lo tanto, esta se propaga en forma de onda. La distancia que se produce entre dos máximos o mínimos de esta onda propagada se denomina longitud de onda.
Los métodos espectrofotométricos de análisis se basan en fenómenos de absorción.
Principios Fundamentales de la Absorción (Leyes de Fotometría)
En las Leyes de Fotometría, se establece que la luz, al atravesar un medio transparente, la intensidad de luz transmitida es siempre menor que la intensidad de la luz incidente.
Ley de Lambert
Lambert, trabajando con placas de vidrio, encontró que si el espesor del medio transparente aumentaba en progresión aritmética (1, 2, 3, 4), la intensidad de la luz transmitida disminuía en progresión geométrica (16, 8, 4, 2).
Ley de Beer
Beer trabajó con soluciones coloreadas de diferentes concentraciones y encontró la misma relación que Lambert: a medida que la concentración de la solución aumentaba en progresión aritmética, la intensidad de la luz transmitida disminuía en progresión geométrica.
Espectro de Absorción y Color
Si queremos medir la concentración de una sustancia en solución, debemos elegir aquella luz que es absorbida con mayor intensidad por la sustancia. La curva que se obtiene al graficar la absorbancia de una sustancia en solución versus longitud de onda se denomina espectro de absorción.
El espectro puede presentar uno o más máximos de absorción, lo que permite identificar a qué longitud de onda el compuesto presenta una máxima absorbancia. (La mayoría de los compuestos presentan máximos de absorbancia en el rango de la luz visible (400-700 nm)).
Rangos de Absorción Específicos
- Compuestos incoloros: Rango UV (200-400 nm).
- Proteínas en solución incoloras: Máximo de 280 nm.
- Ácidos nucleicos: 260 nm.
Color Complementario
La relación entre la luz absorbida y el color percibido es fundamental en colorimetría:
- Rojo (620-760 nm) - Verde (500-570 nm)
- Amarillo (570-590 nm) - Violeta (400-450 nm)
- Naranja (590-620 nm) - Azul (450-500 nm)
Instrumentación y Calibración
Fotocolorímetros y Filtros
Los Fotocolorímetros son instrumentos diseñados para seleccionar el color útil para la medición que se desee.
Los Filtros coloreados se interponen entre la fuente luminosa y la solución que se va a medir. Estos filtros, además de su color, pueden identificarse por su longitud de onda que regularmente llevan grabada:
- Rojo: 640 nm
- Naranja: 600 nm
- Amarillo: 590 nm
- Verde: 540 nm
- Azul: 470 nm
- Violeta: 420 nm
Otros modelos de fotómetros poseen un monocromador interno conectado a un control que permite seleccionar la longitud de onda que se desea obtener.
Curvas de Calibración
Para determinar la concentración de una sustancia en solución, es necesario que dicha solución posea un máximo de absorbancia. Si la sustancia no es coloreada, no absorbe luz visible, por lo cual es necesario aplicar una reacción química que genere un compuesto con un máximo de absorbancia en el rango visible, UV o IR.
Cuando se quiere medir la concentración en un fotocolorímetro, es indispensable mantener constante el espesor y el largo de la solución. Para esto se usan tubos especiales con las dimensiones correspondientes para ser colocados en los portacubetas de los instrumentos (cubetas o tubos de fotómetro).
Determinación de la Concentración de una Solución
La concentración (c) se calcula mediante la fórmula:
$$c = \frac{A}{K}$$
Para calcular la concentración, debemos conocer la absorbancia (A) de la solución y el valor del factor K.
El valor del factor K puede calcularse empíricamente realizando una curva de calibración, midiendo la absorbancia de una serie de soluciones de concentraciones crecientes (Soluciones Patrones).
Una vez obtenidos los valores, se grafica A vs Concentración.
Utilidad del Gráfico de Calibración
Este gráfico permite:
- Determinar los límites de concentración (absorbancia-concentración).
- Obtener el valor de K mediante el cálculo de la pendiente de la recta.
- Calcular el valor de K para cada punto de la recta ($$K = \frac{A}{c}$$) y luego obtener el K promedio.