Fundamentos de la Catálisis Enzimática: Cinética, Factores y Métodos de Análisis

Catalizador: Sustancia que aumenta la velocidad a la que ocurre una reacción (disminuyendo la energía de activación), sin ser consumido ni alterar su estado de equilibrio químico. Es efectivo en pequeñas cantidades.

Ribozimas: Moléculas de ARN con actividad catalítica.

Energía de activación: Energía mínima necesaria para que se produzca una reacción.

Estado de transición: Combinación de moléculas para formar un intermediario activado (cuando se alcanza la energía suficiente).

Cambio de energía libre (ΔG): Diferencia de energía libre entre el estado inicial (sustrato) y el producto final.

Actividad Enzimática

La actividad enzimática se mide determinando la cantidad de producto formado (o de sustrato consumido) por unidad de tiempo. Inicialmente, la relación es lineal, luego se vuelve asintótica.

Factores que Modifican la Actividad Enzimática

• Concentración de la enzima
• Concentración del sustrato
• Temperatura
• pH
• Inhibidores

Unidad de enzima: Cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 micromol de sustrato por minuto bajo condiciones definidas.

Análisis de la Curva de Progreso

El análisis de la curva de progreso es una forma de medir las reacciones ajustando sus datos a una ecuación no lineal.

Efectos de la Concentración de la Enzima

La actividad enzimática es directamente proporcional a la concentración de la enzima (con factores ambientales constantes).

Efecto de la Concentración del Sustrato y la Velocidad de Reacción

Ecuación de Michaelis-Menten: Relaciona la velocidad de la reacción y la concentración del sustrato.

Km (Constante de Michaelis-Menten): Indica el grado de afinidad de la enzima por el sustrato. Es inversamente proporcional a la fuerza de unión entre la enzima y el sustrato (+Km = -afinidad).

Fases de la Reacción Enzimática

1. Fase 1: La velocidad es directamente proporcional a la concentración (orden 1). A mayor concentración, mayor velocidad.
2. Fase 2: La velocidad es independiente de la concentración (orden 0). La enzima está saturada por el sustrato, por lo que la velocidad se mantiene constante.

Efectos de la Temperatura en la Actividad Enzimática

Cada enzima tiene una temperatura óptima (evitando la desnaturalización que produciría un descenso de la actividad enzimática). Para mamíferos es 37°C, para bacterias termófilas es superior a 65°C.

Efecto del pH en la Actividad Enzimática

El pH óptimo de la enzima refleja su ambiente celular donde su actividad enzimática es máxima. Valores menores o mayores a este producen cambios de polaridad en radicales de aminoácidos, afectando la conformación de la proteína.

Métodos de Análisis

Para identificar enzimas se usa su especificidad por las reacciones que catalizan, conociendo sus sustratos y productos.

Controles

• Blanco sustrato: Mezcla semejante a la mezcla que se desea detectar, pero donde se reemplaza la solución que contiene el sustrato por un volumen equivalente de su solvente.
• Blanco enzima: Mezcla semejante a la mezcla a detectar, pero donde se reemplaza la solución que contiene la enzima por un volumen equivalente de su sustrato.
• Tiempo cero: La reacción es detenida en el momento mismo en el que se inicia. Generalmente, una reacción enzimática se inicia con la adición de la enzima o el sustrato.

El análisis se realiza mediante un espectrofotómetro, que determina la absorción de la luz a determinadas longitudes de onda, relacionada con la concentración.

Ejemplo: Invertasa

La invertasa hidroliza la sacarosa (sustrato) obteniendo glucosa y fructosa (productos). Se analiza a tiempo fijo, deteniendo la reacción usando el reactivo 3,5-DNS y midiendo su poder reductor de productos.