Fundamentos de Biología Molecular: Retrovirus, Expresión Génica, Clonación y Terapias Celulares Avanzadas

Ciclo Vital de los Retrovirus

El retrovirus se une a la membrana de los linfocitos T (LT) y penetra en la célula. Una vez dentro, se deshace de su cápside proteica, liberando sus hebras de ARN y las enzimas retrotranscriptasas (transcriptasas inversas).

Estas enzimas utilizan una de las cadenas de ARN viral como molde para sintetizar una cadena de ADN complementario (ADNc), formando un híbrido ARN-ADN. Posteriormente, la hebra de ARN original es degradada por una actividad ribonucleasa H de la transcriptasa inversa, y la enzima sintetiza una segunda cadena de ADN complementario utilizando la primera cadena de ADNc como molde. Se forma así una doble hélice de ADN vírico.

Este ADN vírico de doble cadena migra al núcleo de la célula huésped y se integra en el genoma de esta, convirtiéndose en un provirus. La integración es catalizada por la enzima viral integrasa.

El provirus puede permanecer latente o actuar como un gen más de la célula, utilizando la maquinaria metabólica de esta para:

• Replicar su ADN junto con el ADN celular durante la división celular.
• Transcribir sus genes a moléculas de ARN vírico. Estas moléculas de ARN pueden servir como genoma para nuevos viriones o como ARN mensajero (ARNm) para la síntesis de proteínas virales.
• Traducir los ARNm virales en los ribosomas de la célula huésped para producir las proteínas estructurales y enzimáticas del virus.

Las glucoproteínas de la envoltura viral son sintetizadas y procesadas a través del retículo endoplasmático y el aparato de Golgi (A.G.). Las vesículas transportan estas glucoproteínas hacia la membrana plasmática de la célula huésped. En la membrana, los componentes virales (genoma de ARN, enzimas, proteínas de la cápside) se ensamblan. Finalmente, los nuevos viriones abandonan la célula mediante un proceso de gemación, adquiriendo su envoltura lipídica (derivada de la membrana celular) con las glucoproteínas virales insertadas, listos para infectar nuevas células.

Comparación de la Expresión Génica: Procariotas vs. Eucariotas

En Células Procariotas

• Organización génica: Los genes son generalmente continuos (no poseen intrones).
• Empaquetamiento del ADN: El ADN (usualmente una molécula circular) está menos empaquetado, localizado en una región denominada nucleoide, y no está asociado a histonas de la misma forma que en eucariotas.
• ARN polimerasa: Se utiliza un solo tipo principal de ARN polimerasa para la transcripción de todos los tipos de ARN (ARNm, ARNt, ARNr).
• Localización de transcripción y traducción: La transcripción y la traducción ocurren de forma acoplada en el citoplasma, es decir, la traducción de un ARNm puede comenzar incluso antes de que la transcripción haya finalizado.
• Estructura del ARNm: Los genes son frecuentemente policistrónicos, lo que significa que un único ARNm puede codificar para varias proteínas diferentes.
• Maduración del ARN: La maduración del ARNm (procesamiento postranscripcional) es limitada o inexistente. Los ARNt y ARNr sí sufren procesamiento.

En Células Eucariotas

• Organización génica: Los genes están frecuentemente fragmentados, conteniendo secuencias codificantes (exones) interrumpidas por secuencias no codificantes (intrones).
• Empaquetamiento del ADN: El ADN es lineal y está densamente empaquetado con proteínas histonas, formando la cromatina, la cual se organiza en cromosomas dentro del núcleo.
• ARN polimerasa: Existen múltiples tipos de ARN polimerasa (ARN polimerasa I, II y III), cada una responsable de transcribir diferentes tipos de genes.
• Localización de transcripción y traducción: La transcripción ocurre en el núcleo, y la traducción en el citoplasma. Estos procesos están separados espacial y temporalmente.
• Estructura del ARNm: Los genes son mayormente monocistrónicos, lo que significa que un ARNm típicamente codifica para una sola proteína.
• Maduración del ARN: La maduración del pre-ARNm es un proceso complejo que incluye:
  • Adición de una caperuza de metilguanosina en el extremo 5' (cap).
  • Adición de una cola de poliadenina (poli-A) en el extremo 3'.
  • Proceso de corte y empalme (splicing) para eliminar los intrones y unir los exones.

Complementariedad de Bases Nitrogenadas:

• ARN: Adenina (A) se aparea con Uracilo (U); Guanina (G) se aparea con Citosina (C).
• ADN: Adenina (A) se aparea con Timina (T); Guanina (G) se aparea con Citosina (C).

Clonación de un Gen en Bacterias

El proceso de clonación de un gen en bacterias, una técnica fundamental en ingeniería genética, generalmente sigue estos pasos:

1. Obtención del plásmido recombinante: Se aísla un plásmido (vector de clonación) de una bacteria y el ADN que contiene el gen de interés (ADN inserto). Ambos se cortan con las mismas enzimas de restricción. Luego, el gen a clonar se une al plásmido mediante la enzima ADN ligasa, formando un plásmido recombinante.
2. Transformación de las bacterias: El plásmido recombinante se introduce en bacterias hospedadoras (generalmente E. coli) que han sido tratadas para ser competentes (capaces de captar ADN exógeno).
3. Selección de bacterias transformadas: Los plásmidos utilizados como vectores suelen llevar genes marcadores, como un gen de resistencia a un antibiótico. Al cultivar las bacterias en un medio que contiene dicho antibiótico, solo crecerán aquellas bacterias que hayan incorporado el plásmido (bacterias transformadas) y, por lo tanto, expresen el gen de resistencia.
4. Cultivo y multiplicación (amplificación): Las bacterias transformadas seleccionadas se cultivan en un medio nutritivo. A medida que las bacterias se dividen, los plásmidos recombinantes también se replican, produciendo múltiples copias del gen insertado.
5. Aislamiento de los plásmidos recombinantes o expresión del gen: Se pueden lisar las bacterias para aislar y purificar grandes cantidades del plásmido recombinante con el gen clonado. Alternativamente, se puede inducir la expresión del gen clonado en las bacterias para producir la proteína codificada por dicho gen.

Terapia Génica: Estrategias Principales

La terapia génica es una técnica experimental que utiliza genes para tratar o prevenir enfermedades. Consiste en introducir material genético en las células de un individuo para corregir un defecto genético o para dotar a las células de una nueva función. Existen dos estrategias principales:

Terapia Génica Ex Vivo

• Procedimiento: Se extraen células del paciente (por ejemplo, células madre de la médula ósea). Estas células se modifican genéticamente en el laboratorio (se transforman o transducen con un vector que contiene la versión funcional o terapéutica del gen). Las células modificadas y seleccionadas se cultivan y luego se reintroducen en el paciente.
• Ventajas:
  • Permite una mayor eficiencia en la modificación genética de las células diana.
  • Facilita la selección y el control de calidad de las células modificadas antes de su administración al paciente, reduciendo riesgos.
• Desventajas:
  • Es un proceso más complejo, laborioso y costoso.
  • Generalmente, es específica para el paciente del cual se extrajeron las células.
  • Requiere una manipulación celular extensa y controles de calidad muy precisos.
  • Aplicable principalmente a células que pueden ser extraídas, cultivadas y reintroducidas fácilmente.

Terapia Génica In Vivo

• Procedimiento: El vector que transporta el gen terapéutico (con la versión normal o funcional del gen) se administra directamente al paciente, por ejemplo, mediante inyección en un tejido específico, por vía intravenosa o por inhalación.
• Ventajas:
  • Técnicamente más sencilla y menos invasiva en términos de manipulación celular externa.
  • Potencialmente menos costosa y aplicable a un mayor número de pacientes y tipos de tejidos.
• Desventajas:
  • Menor eficiencia en la transducción de las células diana en comparación con la estrategia ex vivo.
  • Más difícil de controlar la especificidad (que el vector alcance solo las células deseadas) y la dosis del material genético en el organismo.
  • Posibles respuestas inmunitarias del paciente contra el vector viral o las células transducidas.
  • Riesgo de efectos secundarios sistémicos.

Células Madre: Características y Tipos

Las células madre son células indiferenciadas que poseen dos características fundamentales que las distinguen de otras células:

• Autorrenovación: Tienen la capacidad de dividirse indefinidamente (o por múltiples ciclos) para producir más células madre idénticas a sí mismas, manteniendo su estado indiferenciado.
• Potencial de diferenciación: Bajo las condiciones fisiológicas o experimentales adecuadas, pueden diferenciarse y dar lugar a diversos tipos de células especializadas con funciones específicas (por ejemplo, células nerviosas, musculares, sanguíneas).

Estas células juegan un papel crucial en las primeras etapas del desarrollo embrionario, generando todos los tejidos y órganos del organismo. En el individuo adulto, participan en la regeneración y reparación de los tejidos dañados.

Células Madre Embrionarias (CME)

• Origen: Se derivan principalmente de la masa celular interna del blastocisto, una estructura que se forma en los primeros días del desarrollo embrionario (aproximadamente 5-7 días después de la fecundación en humanos).
• Potencialidad: Son pluripotentes, lo que significa que tienen la capacidad de diferenciarse en células derivadas de las tres capas germinales primarias del embrión (ectodermo, mesodermo y endodermo) y, por lo tanto, pueden generar virtualmente cualquier tipo celular del cuerpo.
• Aplicaciones potenciales: Se investigan intensamente para su uso en medicina regenerativa, con el objetivo de reemplazar tejidos y órganos dañados por lesiones o enfermedades (como diabetes, enfermedades cardíacas, Parkinson). También son valiosas para el estudio del desarrollo embrionario y para el cribado de fármacos.
• Autorrenovación: Poseen una capacidad de autorrenovación teóricamente ilimitada cuando se cultivan en condiciones adecuadas en el laboratorio.
• Consideraciones éticas: Su obtención a partir de embriones humanos ha generado un importante debate ético.

Células Madre Adultas (o Somáticas)

• Origen: Se encuentran en pequeñas cantidades en diversos tejidos y órganos ya formados del organismo adulto (por ejemplo, en la médula ósea, piel, tejido adiposo, sangre del cordón umbilical, cerebro, hígado).
• Potencialidad: Son generalmente multipotentes, lo que significa que pueden diferenciarse en un rango limitado de tipos celulares, usualmente aquellos específicos del tejido del que provienen. Por ejemplo, las células madre hematopoyéticas de la médula ósea pueden generar todos los tipos de células sanguíneas (glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas), pero no células nerviosas o musculares. Algunas células madre adultas pueden ser oligopotentes o incluso unipotentes.
• Función fisiológica: Su función principal en el organismo es mantener y reparar el tejido en el que residen, reemplazando las células que mueren por envejecimiento o daño.
• Características y aplicaciones:
  • Su aislamiento puede ser más complejo y suelen ser escasas en los tejidos.
  • Su capacidad de proliferación en cultivo es más limitada en comparación con las CME.
  • Su uso en investigación y terapia presenta menos controversias éticas que el de las CME, ya que pueden obtenerse del propio paciente (autólogas) o de donantes compatibles.
  • Ya se utilizan en tratamientos establecidos, como los trasplantes de médula ósea para tratar leucemias y otras enfermedades hematológicas.