Fundamentos de Biología Molecular: Purificación de Plásmidos, Calidad de Ácidos Nucleicos e Hibridación
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Purificación de Plásmidos
Los plásmidos son muy útiles en el ámbito del ADN recombinante, donde se emplean como vectores para clonar secuencias genéticas. El principal desafío radica en su purificación, ya que es necesario separarlos del ADN cromosómico bacteriano y del ARN bacteriano. Para ello, se utilizan dos técnicas principales:
Centrifugación en Gradiente de Densidad
Esta técnica se basa en la diferencia de densidad de ambos tipos de moléculas. Una vez purificado el ADN bacteriano, se somete a una ultracentrifugación en cloruro de cesio. Dado que el ADN plasmídico y el ADN cromosómico tienen densidades diferentes, esto permite su separación en bandas diferenciadas.
Lisis Alcalina
Esta técnica se basa en las diferencias en el proceso de desnaturalización/renaturalización de ambos tipos de moléculas. Consta de varias fases clave:
I. Lisis Alcalina
Una vez resuspendidas las bacterias, se les añade una solución de lisis alcalina compuesta por un detergente aniónico (SDS) e hidróxido sódico. Durante el periodo de incubación, se produce la lisis de las bacterias por el SDS y la desnaturalización del ADN.
II. Neutralización Rápida
Se añade a la mezcla una solución de acetato potásico, lo que provoca una brusca neutralización del pH y una alta concentración salina. Esto induce la precipitación de la sal potásica, que es insoluble.
III. Purificación del ADN Plasmídico
El sobrenadante se transfiere a un tubo limpio y se trata con ARNasa para eliminar el ARN contaminante, procediendo luego a su purificación final.
Calidad de los Ácidos Nucleicos Purificados
La evaluación de la calidad de los ácidos nucleicos es crucial para asegurar la fiabilidad de experimentos posteriores. Uno de los parámetros más importantes es la integridad.
Integridad de los Ácidos Nucleicos
La integridad es el parámetro que determina si un ácido nucleico conserva su tamaño original. La mejor manera de evaluar la integridad es mediante electroforesis en gel de agarosa. Dependiendo del tipo de ácido nucleico, la electroforesis varía:
ADN Genómico
En las muestras donde el ADN haya mantenido su integridad, se obtendrá una banda única de ADN perfectamente definida en la parte superior del gel. Si el ADN se fragmenta, aparecerá una estela fluorescente.
ADN Plasmídico
Se obtiene una única banda en la electroforesis correspondiente al plásmido con estructura nativa. También puede observarse una banda más débil correspondiente al plásmido con una estructura relajada.
ARN
Aparece un ligero smear (mancha difusa), debido al ARNm, junto con dos bandas nítidas correspondientes a los ARNr.
Concepto de Hibridación y su Aplicación en Biología Molecular
La hibridación de ácidos nucleicos consiste en la unión de dos moléculas monocatenarias de ácidos nucleicos, gracias a la complementariedad de sus secuencias de bases nitrogenadas, originando una molécula híbrida bicatenaria. Las técnicas de hibridación permiten detectar secuencias concretas de ácidos nucleicos (o secuencias diana) mediante el empleo de sondas marcadas.
Secuencia Diana
Es la secuencia de bases nitrogenadas que se pretende detectar.
La Sonda
Es la cadena de nucleótidos cuya secuencia es complementaria a la secuencia diana.
Existen diferentes criterios para clasificar los tipos de hibridación, que incluyen:
- El tipo de ácido nucleico que se pretende detectar.
- El tipo de sonda que se va a utilizar.
- El tipo de marcaje de la sonda.
- El medio o soporte en el que se realiza la hibridación.
Factores que Influyen en la Hibridación
El híbrido sonda/secuencia diana posee las mismas propiedades que una molécula bicatenaria de ADN en cuanto a desnaturalización y renaturalización. Un factor clave que puede modificar la Tm (temperatura de fusión) de un híbrido e influir en la hibridación es la fuerza iónica de la solución. Las moléculas de ácidos nucleicos tienen una carga eléctrica neta negativa. Este fenómeno estabiliza la doble hélice y disminuye la repulsión electrostática.
Tipos y Características de las Sondas
Las sondas utilizadas en hibridación poseen características fundamentales que determinan su eficacia:
Especificidad
Es la capacidad que tiene una sonda para discriminar la secuencia diana con la que debe hibridar. Para que sea específica, su longitud ideal suele ser de al menos 16 bases.
Sensibilidad
Es la probabilidad de detectar cantidades mínimas del híbrido sonda-diana.
Purificación de la Sonda Marcada
Consiste en la eliminación de nucleótidos libres marcados para evitar el ruido de fondo o interferencias en los resultados de las técnicas de hibridación.