Fundamentos de Biología Molecular: Procesos, Extracción de Muestras y Métodos de Purificación

Procesos Centrales de la Biología Molecular

Replicación del ADN

Proceso por el cual se generan dos cadenas de ADN a partir de una sola. Suele ocurrir justo antes de que la célula se divida para que cada célula hija tenga su núcleo. Es un proceso semiconservativo: se conserva una hebra antigua y sobre esa se fabrica la nueva por complementariedad de bases.

Transcripción

Ocurre en el núcleo y es el proceso por el que el ADN se copia a ARNm, permitiendo que la información contenida en el ADN salga del núcleo y se exprese.

Traducción

Se lleva a cabo en el citoplasma y consiste en transformar la información transportada por el ARNm en proteína. Participan en este proceso el ARNm, los ARNt complementarios a los codones del mensajero y los ribosomas.

Preparación y Lisis de Muestras Biológicas

Métodos de preparación inicial para la extracción de ácidos nucleicos o proteínas a partir de diferentes tipos de muestras:

Cultivo celular en monocapa

Despegar la monocapa de células adheridas a la pared del frasco de cultivo mediante un raspador o tratamiento con tripsina al 0.1 - 0.25%.

Esputo

Fluidificación con N-acetil-L-cisteína (NALC) en una disolución de citrato sódico. Si se van a estudiar ácidos nucleicos de micobacterias, la muestra se trata también con hidróxido sódico para descontaminar.

Sangre

Lisis de los hematíes con una solución de lisis de eritrocitos, centrifugación y eliminación del sobrenadante.

Tejido vegetal fresco

Homogeneización mecánica (por ejemplo, pulverización del tejido en un mortero con nitrógeno líquido) u homogeneización química con proteasas y detergentes.

Biopsia de tejido animal fijado en formol e incluido en parafina

Desparafinado y rehidratación de tres cortes de 10 nanómetros obtenidos de microtomo, mediante tratamiento secuencial con xilol, etanoles de graduación decreciente (100%, 96%, 70%) y agua destilada. A continuación, se somete el tejido a homogeneización química con proteasas y detergentes.

Métodos de Purificación y Separación Molecular

Cromatografía de adsorción

Adsorción a sílice en presencia de sales caotrópicas.

Solventes orgánicos

Aprovecha la distinta solubilidad de los componentes del lisado en solventes orgánicos.

Cromatografía de intercambio iónico

Unión reversible electrostática de iones a grupos funcionales.

Salting-out

Precipitación de proteínas con altas concentraciones salinas.

Ultrafiltración

Retención por tamaño de las moléculas de ácidos nucleicos.

Esferas magnéticas

Adsorción o unión por afinidad a microesferas magnéticas.

Reactivos Clave en la Extracción de Plásmidos (Lisis Alcalina)

Dodecil sulfato sódico (SDS) en el tampón de lisis

Solubilización de membranas y paredes, liberando el contenido citoplásmico al medio.

Hidróxido sódico en el tampón de lisis

Desnaturalización del ADN, tanto del cromosoma bacteriano como de los plásmidos.

Acetato potásico en la solución de neutralización (pH 4.8)

Produce la neutralización brusca del medio, evitando que el cromosoma bacteriano renaturalice adecuadamente, mientras que los plásmidos sí lo hacen.

Por otro lado, precipita proteínas y forma la sal potásica del dodecil sulfato insoluble. Los agregados que forman ambos componentes atrapan la maraña de ADN cromosómico, que precipita al centrifugar.

ARNasa

Degrada el ARN presente en el medio.

Clasificación y Funciones del ARN

ARNm (mensajero)

Contiene la información para la síntesis de proteínas.

ARNt (transferencia)

Contiene hasta un 10% de bases nitrogenadas raras.

ARNr (ribosómico)

Combinado con proteínas forma los ribosomas.

ARNmi (microARN)

Está implicado en la regulación de la expresión génica.

ARNhn (heterogéneo nuclear)

Tras un proceso de maduración se transforma en ARNm.

ARNsn (nuclear pequeño)

Forma ribonucleoproteínas con actividad enzimática.

ARNsno (nucleolar pequeño)

Es el precursor de varios ARN ribosómicos.