Fundamentos de Biología Molecular: Extracción de ADN, RT-PCR y Secuenciación

Extracción de ADN Genómico: Consideraciones Metodológicas

Una estudiante está realizando una extracción de ADN genómico. A continuación, se detallan las justificaciones de algunos pasos clave:

1. Degradación del ARN

• Se utiliza ARNasas altamente estables que degradan el ARN, asegurando que el producto final sea ADN puro.

2. Uso de la Sal y Estabilidad Molecular

2.1. Función de la Sal en la Extracción

La sal modifica la estructura de las moléculas e interactúa fuertemente con el agua, reduciendo así sus propiedades de solvatación. Esto cambia la estructura del ADN, al igual que su carga eléctrica, lo cual favorece la unión a las matrices de sílice (membranas de la columna).

2.2. Estabilidad del ADN frente al ARN

El ADN es una molécula más estable y robusta debido a su doble hélice, por lo que se degrada con mayor dificultad en comparación con el ARN, que es monocatenario y más susceptible a la hidrólisis.

Métodos de Separación y Detección de ARNm

¿Cómo separar los ARNm obtenidos?

Se pueden aprovechar las características estructurales del ARNm para su aislamiento y manipulación:

1. Cromatografía de Afinidad: Aprovechando la cola de adeninas (poli-A) que la mayoría de los ARNm presentan en su extremo 3'. Esta cola puede utilizarse para separar los ARNm mediante cromatografía de afinidad por oligosacáridos dT (oligo-dT).
2. Transcripción Inversa: El ARNm sirve de molde para la unión de un cebador (primer) y la posterior realización de una transcripción inversa, sintetizando una cadena de ADN complementario (ADNc) a partir de un molde de ARN por acción de la transcriptasa inversa.
3. Técnica de la RT-PCR: El molde inicial es ARN y se emplea la enzima transcriptasa inversa para realizar la conversión de ARN a ADN complementario, que luego se amplifica por PCR.
4. Electroforesis en Gel de Agarosa: Utilizada para la separación y visualización de los ácidos nucleicos por tamaño.

Diferencias Clave en Reacciones de Amplificación y Secuenciación

Diferencia principal entre la reacción de secuenciación y la PCR normal

Aplicación de Microarrays (Microchips)

Protocolo básico de uso de Microchips

Los microchips permiten estudiar la expresión génica de miles de genes simultáneamente. El proceso general incluye:

1. Se aísla el ARNm total de células en dos fases o condiciones experimentales diferentes.
2. El ARNm se convierte en ADNc usando RT-PCR y dNTP, incorporando un marcador fluorescente (sondas que se hibridarán a las secuencias del microchip).
3. Se mezclan los ADNc de las dos muestras antes de usarse como sonda con el microchip.
4. Los ADNc fluorescentes se hibridan con secuencias complementarias inmovilizadas en el microchip.
5. Cada mancha fluorescente representa un gen de la muestra, y la intensidad del color indica el nivel de expresión.

Purificación de ADN mediante Columnas NucleoSpin

Elementos y función de los componentes NucleoSpin

FILTER (Filtro)

Filtración del lisado crudo para eliminar restos celulares grandes.

COLUMNA (Membrana de Sílice)

Sitio de unión del ADN en presencia de altas concentraciones de sales caotrópicas.

BUFFER PC (Tampón de Unión)

Ajusta las condiciones (pH y concentración de sales) para la unión óptima del ADN a la membrana.

BUFFER PW1 y PW2 (Tampones de Lavado)

Lavado y secado de la membrana de sílice para eliminar contaminantes (sales, proteínas, etc.).

BUFFER PE (Tampón de Eluición)

Eluición del ADN purificado (generalmente agua o un tampón de baja fuerza iónica, como Tris-EDTA).

Composición y función del Tampón de Extracción (Lisis)

Tampón Tris

Mantiene la neutralidad (pH estable).

EDTA

Inhibe las nucleasas al quelar (eliminar) los cationes divalentes (Mg²⁺, Ca²⁺) necesarios para su actividad.

NaCl

Estabiliza las moléculas y previene agregados de proteínas.

SDS (Detergente Iónico)

Desestabiliza la membrana celular y desnaturaliza proteínas. No afecta la estructura robusta del ADN.

Proteinasa K

Ayuda a la lisis celular porque digiere las proteínas y libera el ADN de complejos proteicos.

Principio básico de la extracción NucleoSpin

Las muestras de plantas se homogeneizan por tratamiento mecánico. El ADN puede ser extraído con los tampones de lisis, que contienen sales caotrópicas, agentes desnaturalizantes y detergentes. Los lisados deben ser aclarados por centrifugación o por filtros de NucleoSpin.

El sobrenadante aclarado se mezcla con el tampón de unión para crear las condiciones adecuadas para la unión óptima del ADN a la membrana de sílice. Una vez cargada esta mezcla en las columnas, se eliminan los contaminantes usando los tampones de lavado. Finalmente, el ADN genómico se eluye con el tampón de eluición.

Caracterización Molecular de Plantas

Pasos para la caracterización molecular de plantas

Para la caracterización molecular, se suelen utilizar herramientas bioinformáticas y secuencias específicas:

1. Uso de la herramienta Primer-BLAST de la base de datos NCBI para el diseño de cebadores.
2. Selección de la secuencia del gen de la enzima Rubisco y de la región intergénica (secuencia de ADN molde) como marcadores.

Datos obtenidos en el diseño de cebadores (primers)

El diseño de cebadores proporciona información crítica para optimizar la PCR:

• Todas las posibles secuencias de oligonucleótidos.
• Secuencia del cebador (primer) necesario.
• Temperatura de alineamiento (Tm) para los cebadores.
• Contenido de G+C de los cebadores.
• Longitud de los cebadores.
• Concentración de cationes (importante para la actividad de la polimerasa).