Fundamentos de Biología Celular: Cromosomas, Ciclo Celular y Cultivos Avanzados

Estructura del Cromosoma Metafásico

El cromosoma metafásico presenta las siguientes estructuras clave:

• Cromátidas

  Estructuras idénticas en morfología e información genética. Se mantienen unidas mediante cohesinas.

• Centrómero

  Punto de contacto de las dos cromátidas hermanas y la frontera entre los dos brazos del cromosoma. Sobre él se sitúan los cinetocoros. Es una región rica en ADN repetitivo, concretamente en ADN satélite.

• Telómero

  Regiones situadas en los extremos de los cromosomas eucarióticos, esenciales para la estabilidad cromosómica.

Tipos de Cromosomas

Los cromosomas se clasifican según la posición de su centrómero:

• Metacéntricos

  El centrómero está en la mitad del cromosoma, haciendo que los dos brazos midan lo mismo.

• Submetacéntricos

  El centrómero está algo desplazado del centro, resultando en un brazo ligeramente más grande que el otro.

• Acrocéntricos

  El centrómero está lejos del centro, con un brazo muy corto y el otro muy largo.

• Telocéntricos

  El centrómero está tan cerca del extremo que solo se observa un brazo.

Número de Cromosomas Humanos

Los humanos tenemos 23 pares de cromosomas (2n=46), de los cuales 23 cromosomas son heredados de la madre y 23 del padre.

• Cromosomas Sexuales

  Responsables de las características diferenciadoras de cada sexo. En humanos, son el X y el Y.

• Cromosomas Autosómicos

  Son los que codifican para todas las características no sexuales.

El Ciclo Celular

El ciclo celular es la sucesión de etapas por las que transcurre la vida de una célula. Se divide en dos grandes fases:

Interfase Celular

Periodo que transcurre entre dos mitosis consecutivas, es decir, entre el final de una división celular y el inicio de la siguiente. Distinguimos:

• Fase G1

  La primera y más larga etapa, y la más variable. En ella se produce el crecimiento celular hasta alcanzar su tamaño óptimo.

• Fase S

  Fase de síntesis, donde se duplica el ADN. La replicación del ADN debe cumplir dos condiciones: debe darse una sola réplica y cometer la menor cantidad de fallos posibles.

• Fase G2

  Segunda etapa de crecimiento celular, preparatoria para la mitosis.

Mitosis: División Celular

La mitosis es la fase más compleja del ciclo celular y supone una mayor reordenación de los componentes celulares. Incluye las siguientes etapas:

• Profase

  Condensación del ADN, de manera que las cromátidas aisladas se hacen visibles. A su vez, ocurre la desaparición del nucléolo y comienza a desorganizarse la membrana nuclear.

• Metafase

  Al final de la profase, las cromátidas hermanas están unidas entre sí y también a los microtúbulos cinetocóricos del huso mitótico, a través del centrómero. Se alinean en el plano ecuatorial.

• Anafase

  Rotura de las conexiones entre cromátidas hermanas a nivel del centrómero, gracias a la participación de proteasas. Se produce el desplazamiento de las cromátidas hermanas a ambos polos de la célula.

• Telofase

  Se organiza de nuevo la envoltura nuclear y aparecen nuevos nucleolos. Los cromosomas comienzan a descondensarse en cada polo.

• Citocinesis

  Etapa final del ciclo celular que supone la separación del citoplasma de la célula madre en dos partes, conformando así las células hijas.

Métodos de Tinción y Bandeo Cromosómico

Estos métodos permiten identificar cada uno de los cromosomas y estudiar su estructura y morfología, siendo cruciales en citogenética:

• Bandeo G

  Técnica más utilizada. Se obtienen bandas claras (G-) y oscuras (G+). Proporciona una tinción permanente y se observa con microscopio de campo claro.

• Bandeo Q

  Utiliza extensiones cromosómicas con mostaza de quinacrina. Permite eliminar la tinción empleada y se observa con microscopio de fluorescencia.

• Bandeo R

  Requiere un tratamiento previo con calor, seguido de tinción con Giemsa. Invierte el patrón de bandeo G.

• Bandeo C

  Implica un tratamiento previo de los cromosomas con HCl. Tiñe específicamente el centrómero y es útil para la evaluación de ciertos polimorfismos.

• Bandas T

  Permiten la identificación de las regiones teloméricas, los extremos de los cromosomas.

• Bandas NOR

  Tinción con nitrato de plata, observada con microscopio de campo claro. Tiñen la región organizadora nucleolar.

Alteraciones Cromosómicas

El cariotipo humano normal está formado por 46 cromosomas: 22 pares de cromosomas autosómicos y 1 par sexual. Las alteraciones cromosómicas pueden ser estructurales o numéricas.

Alteraciones Estructurales Cromosómicas

Implican cambios en la estructura de uno o varios cromosomas:

• Translocaciones

  Cambio de una parte entre dos cromosomas. Pueden ser recíprocas, robertsonianas o insercionales.

• Inversiones

  Inversión de un segmento dentro del mismo cromosoma. Normalmente, no tienen repercusiones fenotípicas si son equilibradas.

• Duplicación

  Repetición de un fragmento cromosómico. Generalmente, tiene repercusión fenotípica.

• Deleción

  Pérdida de un fragmento de material genético. Suele tener repercusión fenotípica significativa.

Alteraciones Numéricas Cromosómicas

Causan un desequilibrio en el número total de cromosomas:

• Aneuploidías

  Variación en el número de cromosomas, como la presencia de un cromosoma extra (trisomía) o la ausencia de uno (monosomía).

• Poliploidías

  Presencia de conjuntos completos adicionales de cromosomas (ej., triploidía).

Diagnóstico Citogenético Prenatal

El diagnóstico prenatal busca identificar alteraciones cromosómicas o genéticas antes del nacimiento. Incluye:

• Cribado Bioquímico del Síndrome de Down

  Se detectan valores elevados o disminuidos de ciertas sustancias en la sangre materna, que pueden indicar un riesgo patológico.

• Estudio Ecográfico

  Identificación de marcadores o anomalías estructurales asociadas a alteraciones cromosómicas.

• Identificación de Padres Portadores

  Estudio genético de los progenitores para detectar portadores de reordenamientos cromosómicos equilibrados.

• Antecedentes Familiares

  Consideración de la historia clínica familiar de alteraciones genéticas o cromosómicas.

Metodología para el Diagnóstico Prenatal Invasivo

Para un diagnóstico definitivo, se utilizan técnicas invasivas:

• Amniocentesis

  Obtención de líquido amniótico mediante punción abdominal del útero. El riesgo de aborto es bajo (entre el 0,2% y el 0,5%).

• Estudio de Vellosidades Coriónicas

  Obtención de un pequeño fragmento del corion o placenta en desarrollo, mediante aspirado o con una aguja a través de punción abdominal.

Tipos de Cultivos Celulares

Los cultivos celulares son fundamentales en la investigación biológica y biotecnológica.

• Cultivo de Órganos

  Consiste en mantener un órgano entero o parte de él en la interfase entre un medio de cultivo artificial y una atmósfera controlada. El órgano se coloca sobre una rejilla en una interfase líquido-gas que permite la nutrición. La ventaja principal es que se conserva la arquitectura característica del tejido.

• Cultivos de Explantes

  Se basan en fragmentos de tejido vivos o explantes. Consiste en adherir un fragmento de tejido a una superficie y nutrirlo con un medio de cultivo. Las células de la periferia se multiplican, proliferan y migran a la superficie del soporte.

• Cultivos de Células

  Implican el crecimiento de células aisladas en un medio. Se distinguen varios tipos:

  • Cultivo Celular Primario

    La suspensión celular de partida se obtiene disgregando las células por métodos enzimáticos o mecánicos directamente de un tejido.

  • Cultivo Celular Secundario

    Se obtiene a partir de un cultivo primario o de otro cultivo secundario mediante un subcultivo o "pase", que implica la resiembra de células.

  • Muestras de Partida

    Cualquier tipo de tejido, sangre periférica o células madre pueden ser utilizadas como muestras iniciales.

  • Tipo Celular

    Grupo de células con un mismo origen, estructura o función, que se mantienen en cultivo.

Curva de Crecimiento de los Cultivos Celulares

El crecimiento de un cultivo celular sigue fases características:

• Fase de Latencia

  Se produce la adaptación de las células al cultivo. No hay crecimiento significativo, por lo que es un tramo recto sin pendiente, generalmente durante las primeras 24 horas.

• Fase Exponencial

  Aumento exponencial del número de células, con una duración aproximada de 6-7 días. Las células se dividen activamente.

• Fase Estacionaria

  Tramo de meseta que ocurre a partir de los 6-7 días. El número de células permanece constante debido a la disminución de nutrientes y la escasez de espacio, igualándose el número de nacimientos con el número de muertes.

• Fase de Declinación

  Fase de muerte del cultivo. Se produce la senescencia de las células, los desechos se acumulan y hay un déficit crítico de nutrientes.

Formas de Crecimiento Celular

Las células en cultivo pueden crecer de dos formas principales:

• Monocapa

  Las células crecen adheridas sobre una superficie sólida. Son dependientes del anclaje y es el método más utilizado para muchos tipos celulares.

• Suspensión

  Las células no necesitan adherirse a una superficie y crecen flotando en el medio. Es común en células sanguíneas circulantes, células madre y algunas líneas tumorales. En suspensión, se distinguen las fases de adaptación al medio (fase de latencia), proliferación en suspensión (fase exponencial) e inhibición por densidad (fase estacionaria).

Comportamiento Vital Tras Sucesivos Pases

El comportamiento de las células cambia con los pases o subcultivos:

• Línea Celular Primaria

  La población celular aumenta en cada pase y normalmente se estabiliza a partir del tercer pase, pero tiene una vida útil limitada.

• Línea Celular Continua

  Células que se diferencian genética y morfológicamente de las células de las cuales se originaron. Pueden provenir de tumores o de un proceso de transformación de un cultivo primario. Las células transformadas tienen las siguientes características:

  • Son inmortales.
  • Pierden la dependencia del anclaje.
  • Pierden la inhibición por contacto.
  • Pueden invadir tejidos y producir tumores (si son malignas).
  • Acumulan anomalías genéticas.

Transfección

La transfección es la introducción de material genético externo (como ADN o ARN) en células eucariotas mediante el uso de plásmidos, vectores víricos u otras técnicas no virales.

Medios de Cultivo Celular

Los cultivos se realizan en medios artificiales preparados, dentro de instrumentos que mantienen las condiciones fisicoquímicas adecuadas. Factores clave incluyen:

• Soporte Físico

  Pueden ser recipientes de vidrio (fáciles de limpiar y esterilizar, permiten observación directa al microscopio) o recipientes de plástico (generalmente desechables).

• Composición y Propiedades Fisicoquímicas del Medio de Cultivo

  Dependen principalmente del tipo celular que se quiera cultivar.

  Composición del Medio de Cultivo

  Un medio de cultivo típico contiene:

  • Soluciones salinas como NaCl, KCl.
  • Aminoácidos esenciales y no esenciales.
  • Vitaminas.
  • Glucosa como fuente de energía.
  • Hormonas y factores de crecimiento.
  • Inhibidores del crecimiento (en algunos casos).
  • Solución tampón para mantener el pH.
  • Indicador de pH (como rojo fenol).

  Características Físico-Químicas del Medio de Cultivo

  Las condiciones ambientales deben ser controladas:

  • Atmósfera Gaseosa

    Mezcla de gases en que se mantienen los cultivos. Los componentes principales son:

    • Concentración de O2: Necesaria para el desarrollo celular.
    • Concentración de CO2: Influye directamente en el pH del medio.

  • Temperatura

    Las células de mamíferos crecen óptimamente a 37ºC.

  • pH

    El valor óptimo suele ser pH=7,4, mantenido por sistemas tampón.

  • Osmolaridad

    Para controlarla, se emplean medios ligeramente hipotónicos o isotónicos, lo que compensa la pérdida de agua y asegura que las células sean hipertónicas respecto al medio.

  • Humedad

    Debe ser suficientemente elevada para evitar pérdidas por evaporación del medio.

Citometría de Flujo

La citometría de flujo es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de células por un haz de luz. Permite obtener información sobre el tamaño celular, el estadio de diferenciación y las características antigénicas de las células.

Aplicaciones del Cultivo Celular

El cultivo celular tiene diversas aplicaciones en investigación y diagnóstico:

• Determinación de Microorganismos Infecciosos

  Permite identificar el microorganismo causante de una infección en un área determinada.

• Diagnóstico Citogenético Postnatal

  La muestra debe llegar fresca al laboratorio e incubarse a 37ºC durante 72 horas desde su inicio para obtener metafases.

• Diagnóstico Citogenético Prenatal

  Complementa las técnicas invasivas, como el estudio de:

  • Líquido Amniótico

    Obtenido mediante amniocentesis, con un riesgo de aborto entre el 0,2% y el 0,5%.

Clonación Molecular y Celular

La clonación es el proceso de amplificación in vivo de secuencias de ADN, basada en la tecnología del ADN recombinante. Implica la introducción de moléculas de ADN recombinante en una célula huésped, que posteriormente se multiplicará en cultivo, generando múltiples copias del ADN de interés.

Participantes en la Clonación

Los elementos esenciales para la clonación son:

• ADN Exógeno

  Es la molécula o segmento de ADN que se desea clonar. Su origen puede variar desde la síntesis química hasta el aislamiento de ADN genómico.

• Vector de Clonación

  Molécula que transporta el ADN exógeno hasta la célula huésped, permitiendo su replicación.

• Célula Huésped

  Célula (eucariota o procariota) que recibe el ADN recombinante, lo conserva y utiliza su maquinaria molecular para amplificarlo. Si la introducción es efectiva, esta célula se convierte en una célula recombinante.

Vectores de Clonación

Un vector de clonación es una molécula de ADN a la cual se une el ADN exógeno para que se pueda producir la transferencia e inserción en el ADN de la célula huésped. Sus propiedades ideales incluyen:

• Capacidad de replicación activa en la célula huésped.
• Tamaño adecuado para facilitar su manipulación.
• No modifica el ADN de la célula huésped de forma indeseada.
• Presencia de sitios de restricción únicos para la inserción del ADN.
• Marcadores de selección que permitan identificar las células que han incorporado el vector.

Vectores Más Utilizados

Entre los vectores de clonación más comunes se encuentran:

• Plásmidos Bacterianos

  ADN bicatenario circular de origen natural, ampliamente usados por su facilidad de manipulación.

• Bacteriófagos

  Virus que infectan bacterias, transmitiéndoles ADN exógeno. Son parásitos intracelulares eficientes.

• Cósmidos

  Híbridos entre plásmidos y fagos, capaces de transportar fragmentos de ADN más grandes.

• BAC (Cromosomas Artificiales Bacterianos)

  Permiten clonar fragmentos muy grandes de ADN en bacterias.

• YAC (Cromosomas Artificiales de Levadura)

  Permiten clonar fragmentos extremadamente grandes de ADN en levaduras.

Células Hospedadoras

Son las células donde se introduce el vector de clonación. Se clasifican en:

• Células Hospedadoras Bacterianas

  Son las más utilizadas, siendo E. coli la bacteria más común. También se emplean otras como Bacillus subtilis.

• Células Hospedadoras Eucariotas

  Incluyen células vegetales y animales. Su uso está más encaminado a la inserción de genes extraños en el genoma de la célula hospedadora y su posterior expresión para obtener organismos transgénicos o proteínas recombinantes.