Fundamentos y Aplicaciones de las Técnicas Inmunológicas: ELISA, RIA y Reacciones Ag-Ac

Fundamentos del Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA)

Componentes Esenciales del ELISA

Un ensayo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) se compone de:

• Fase sólida (placa de pocillos)
• Conjugado (anticuerpo o antígeno marcado con enzima)
• Sustrato (cromógeno)
• Solución de parada (Stop Solution)
• Lector ELISA (espectrofotómetro)

Variantes y Principios del ELISA

• ELISA Competitivo de Antígeno: Se emplean pocillos recubiertos de anticuerpo.
• ELISA Indirecto y Directo: Se emplean pocillos recubiertos de antígeno.

Principio del ELISA Directo

Anticuerpo + Muestra → Conjugado (Ac marcado) → Sustrato → Color → Lavar → Leer.

Aplicaciones Diagnósticas del ELISA

El ELISA se utiliza para la determinación de anticuerpos (IgG e IgM, y en algunos casos IgA) contra diversos patógenos, incluyendo:

• Mycoplasma pneumoniae
• Chlamydia pneumoniae
• Herpes simple 1 y 2
• Citomegalovirus (CMV)
• Virus de Epstein-Barr (EBV)
• Virus Varicela-Zóster (VZV)
• Bordetella pertussis (IgG, IgM e IgA)

Interacciones Fundamentales Antígeno-Anticuerpo (Ag-Ac)

Propósito de las Reacciones Ag-Ac

Las reacciones antígeno-anticuerpo son cruciales para:

1. Diagnóstico de enfermedades.
2. Vigilancia del grado de respuesta inmunitaria.
3. Identificación de moléculas de interés biológico.

Naturaleza de la Unión Ag-Ac

La unión Ag-Ac se basa en interacciones no covalentes, que incluyen:

• Enlaces de hidrógeno.
• Enlaces iónicos.
• Fuerzas de Van der Waals.

Se requiere un gran número de estas interacciones débiles para formar un complejo Ag-Ac estable.

Reacción Cruzada

En algunos casos, un anticuerpo estimulado por un antígeno puede reaccionar de forma cruzada con un antígeno no relacionado, debido a que ambos comparten un epítopo idéntico o muy similar.

Reacciones de Precipitación

Los anticuerpos que aglomeran antígenos solubles se denominan precipitinas. La formación visible del precipitado generalmente requiere de 1 a 2 días.

Requisitos para la Formación del Retículo

La formación de un retículo (red) de Ag-Ac, esencial para la precipitación, depende de la valencia del anticuerpo y del antígeno:

• El anticuerpo debe ser bivalente. No se forma un precipitado con fragmentos Fab monovalentes.
• El antígeno debe ser bivalente o polivalente, es decir, debe tener al menos dos copias del mismo epítopo que puedan reaccionar con distintos anticuerpos presentes en un antisuero policlonal.

Métodos de Cuantificación: Inmunodifusión e Inmunoelectroforesis

Existen diversas técnicas para determinar la concentración de complejos Ag-Ab, generalmente realizadas en un medio semisólido como el agar.

Inmunodifusión Radial (Técnica de Mancini)

En esta técnica, se coloca una muestra de antígeno en un pocillo y se deja difundir en un gel de agar que contiene una dilución de antisuero. La reacción forma un anillo de precipitación (o anillo de precipitina), cuyo diámetro es proporcional a la concentración del antígeno.

Inmunodifusión Doble (Técnica de Ouchterlony)

Tanto el antígeno como el anticuerpo difunden uno hacia el otro desde pocillos separados, formando líneas de precipitación donde se encuentran en proporciones óptimas.

Inmunoelectroforesis

1. Se separa la mezcla de antígenos por electroforesis en función de sus cargas.
2. En el gel, en paralelo a la separación, se añade antisuero.
3. El antígeno y el anticuerpo difunden uno hacia el otro, resultando en la formación de líneas de precipitación.

Aglutinación y el Fenómeno Prozona

La interacción Ag-Ab también puede resultar en aglutinación (agrupamiento visible de partículas). Los anticuerpos que causan este fenómeno se denominan aglutinas.

Las reacciones de aglutinación son similares a las de precipitación, ya que dependen del enlace cruzado de antígenos polivalentes.

El Efecto Prozona

El efecto prozona ocurre cuando un exceso de anticuerpo inhibe las reacciones de aglutinación, llevando a un falso negativo o a una subestimación de la concentración real.

Causas del Efecto Prozona

1. Concentraciones excesivamente altas de anticuerpo.
2. El número de sitios de unión del anticuerpo excede la disponibilidad del epítopo.

Cuando hay un exceso de anticuerpo, todos los anticuerpos se unen a los antígenos de manera univalente en lugar de multivalente. Los anticuerpos unidos de forma univalente no pueden enlazar de forma cruzada un antígeno con otro, impidiendo la formación del retículo visible.

Anticuerpos Incompletos

El efecto prozona también puede deberse a que el antisuero contenga altas concentraciones de anticuerpos que se unen al antígeno pero no inducen aglutinación (anticuerpos incompletos). Estos anticuerpos incompletos, a menudo de clase IgM, o a concentraciones altas de IgG, pueden ocupar la mayoría de los sitios antigénicos y bloquear el acceso a la IgM, que es una buena aglutinina.

Radioinmunoensayo (RIA): Detección de Alta Sensibilidad

El Radioinmunoensayo (RIA) es una de las técnicas más sensibles para detectar antígeno o anticuerpo, siendo útil para medir:

• Hormonas.
• Proteínas séricas.
• Fármacos y vitaminas.

El RIA permite la detección a concentraciones extremadamente bajas (hasta 0.001 µg/mL).

Principio de la Competencia en RIA

El principio del RIA implica la unión competitiva de un antígeno radiomarcado y un antígeno no marcado (de la muestra) a un anticuerpo de alta afinidad.

1. El antígeno marcado se mezcla con el anticuerpo a una concentración que satura los sitios de unión Ag-Ab.
2. Se añaden cantidades crecientes de la muestra (antígeno no marcado de concentración desconocida).
3. El anticuerpo no distingue entre el Ag marcado y el no marcado, por lo que los dos tipos de Ag compiten por los sitios de unión disponibles en el anticuerpo.

Cuantificación

Conforme aumenta la concentración de antígeno no marcado, más antígeno con la marca radiactiva es desplazado de los sitios de unión. El decremento de la cantidad de Ag radiomarcado que se une al anticuerpo específico en presencia de la muestra se mide para determinar la cantidad de antígeno que hay.

Marcadores Radiactivos

Los antígenos se marcan comúnmente con el isótopo ¹²⁵I (Yodo-125) o tritio (³H).

Consideraciones Técnicas

La muestra de estudio puede ser suero u otro líquido corporal que contenga el antígeno no marcado. Se utiliza entre el 50% y el 70% de una cantidad fija de Ag radiactivo en la mezcla por valorar. La relación entre el anticuerpo y el Ag radiactivo asegura que la cantidad de epítopo que el antígeno marcado presenta siempre exceda el número total de sitios de unión del anticuerpo.