Fundamentos y Aplicaciones de PCR y ELISA en Biología Molecular

Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La PCR permite, partiendo de un pequeño fragmento de ADN, obtener un gran número de copias en tan solo unas horas. Para ello, debemos sintetizar unos oligonucleótidos adecuados que hibriden con el principio y el final del fragmento que deseamos amplificar. Estos oligos actúan como primers (cebadores). La PCR consiste en incubar la muestra de ADN con la enzima polimerasa, dNTPs y los oligonucleótidos sintetizados. Esta mezcla de ensayo se somete a una serie de ciclos de temperatura.

Etapas de la PCR

• Inicio

  Este paso consiste en llevar la reacción hasta la temperatura de 94-96ºC, que se mantiene durante 1-9 minutos. Este paso es necesario para ADN-polimerasas que requieran activación por calor.

• Desnaturalización

  En primer lugar, se desnaturaliza el ADN. Puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento de la muestra lo más habitual.

• Alineamiento (Unión del Cebador)

  A continuación, se producirá la hibridación del cebador, que se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello, es necesario bajar la temperatura durante 20-40 segundos, permitiendo así el alineamiento. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN.

• Extensión (Elongación de la Cadena)

  Actúa la ADN-polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN añadiendo los dNTPs en dirección 5’→3’.

• Elongación Final

  Etapa única que se lleva a cabo a 70-74ºC durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella, se asegura que cualquier ADN sea totalmente ampliado.

Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA)

El ELISA se basa en la detección de un antígeno (Ag) inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos (Ac) que, directa o indirectamente, producen una reacción cuyo producto (por ejemplo, un colorante) puede ser medido espectrofotométricamente.

Tipos de Ensayo ELISA

• ELISA Directo

  Las placas se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el Ag. Se incuban con Ac marcados. Indican la presencia de Ag en la solución analizada. Es necesario incluir controles negativos, que serán muestras del mismo tipo de las analizadas pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del Ag buscado. Asimismo, se incluyen controles positivos, donde se encuentra el Ag buscado.

• ELISA Indirecto

  Las placas se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos Ac: uno primario contra el Ag, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señal debida a la unión de dos o más Ac secundarios por cada Ac primario.

• ELISA Sándwich

  Se recubre el pocillo con un Ac de captura. Después de lavar el exceso de Ac, se aplica la muestra problema en la que se encuentra el Ag, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer Ac. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido, se aplica una solución con un segundo Ac anti-Ag marcado. Así, cada molécula de Ag estará unida a un Ac en la base que lo retiene y a un segundo Ac que lo marca.

Fases de un Ensayo ELISA

• Conjugación del Ac o del Ag

  Con una enzima. El Ac conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos, indirectos, sándwich, etc. El Ag marcado se emplea en ensayos de competición de Ag.

• Unión del Ag (o del Ac) a los Pocillos

  La unión de Ac o Ag se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.

• Formación de una o más Capas de Inmunocomplejos

  Empleando un Ac primario anti-Ag y un secundario anti-primario marcado. Este método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más Ac secundarios a cada Ac primario.

• Revelado de la Reacción Enzimática

  Después de un lavado para eliminar todas las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos, se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (A) mediante espectrofotometría UV-Vis.