Fundamentos y Aplicaciones de la PCR Cuantitativa en Tiempo Real

Consideraciones en la Cuantificación con Agentes Intercalantes (SYBR Green)

La evaluación de los resultados en la curva de fusión es crucial, ya que permite discriminar productos de amplificación inespecíficos.

Los agentes intercalantes, como el SYBR Green, presentan ciertas limitaciones. Por ejemplo, no son aptos para PCR multiplex. Cuando se utiliza SYBR Green, es indispensable asegurar condiciones de PCR óptimas y un diseño de primers exacto. Los primers deben diseñarse de forma que el amplicón contenga secuencias de diferentes exones, si el objetivo es analizar ARNm.

Es recomendable iniciar la síntesis de ADN a temperaturas elevadas, lo que disminuye la formación de inespecificidades. Para ello, se utilizan polimerasas Taq modificadas que se activan a altas temperaturas (hot-start).

Limitaciones Específicas de los Agentes Intercalantes

Los agentes intercalantes no permiten la identificación de polimorfismos en la secuencia de amplificación, lo cual es una desventaja significativa en ciertas aplicaciones.

Uso de Sondas en la Cuantificación de Ácidos Nucleicos

El uso de sondas, aunque más costoso, es altamente recomendado cuando existen problemas de especificidad en la amplificación.

Ventajas y Aplicaciones de las Sondas

Las sondas permiten la cuantificación del ADN de interés incluso en presencia de amplificación inespecífica, lo que mejora la fiabilidad de los resultados. Para el análisis de secuencias específicas, se emplean sondas marcadas con fluorocromos.

Mecanismo de Acción de las Sondas de Hidrólisis (TaqMan)

Las sondas de hidrólisis (comúnmente conocidas como sondas TaqMan) emiten fluorescencia cuando la actividad exonucleasa 5'-3' de la polimerasa Taq las separa de la secuencia diana. Estas sondas contienen un fluoróforo y un quencher fluorescente, que se encuentran cercanos entre sí, impidiendo la emisión de fluorescencia en su estado intacto.

Cuando la polimerasa alcanza la sonda durante la amplificación, esta es hidrolizada, separando el fluoróforo del quencher y permitiendo así la emisión de fluorescencia.

Una ausencia de señal de fluorescencia indicaría que la región complementaria a la sonda diseñada no está presente en la secuencia diana de amplificación.

Cuantificación de Ácidos Nucleicos por PCR en Tiempo Real

Principios y Aplicaciones Generales

La PCR en Tiempo Real (qPCR) ofrece una amplia gama de aplicaciones al ser capaz de cuantificar de manera absoluta o relativa moléculas molde de ADN o ARN. Se utiliza para determinar la carga viral, el título de gérmenes y la presencia de contaminantes en muestras como alimentos, sangre, etc.

Tipos de Cuantificación

Cuantificación Absoluta

El número de copias de la secuencia diana al inicio de la reacción se puede cuantificar a través del ciclo umbral (Ct). El Ct es el número de ciclos necesarios para que se produzca un aumento de fluorescencia significativo, y es inversamente proporcional a la cantidad inicial de moléculas molde.

Este método utiliza estándares de concentración conocida para generar curvas estándar. Estas curvas establecen relaciones lineales entre el Ct y la cantidad inicial de ADN o ARN, permitiendo la cuantificación mediante la aplicación de la ecuación de la recta.

Cuantificación Relativa

La cuantificación relativa se utiliza principalmente para medir la expresión génica mediante qPCR. En este método, se compara la expresión del gen de interés entre diferentes muestras, normalizándola respecto a la expresión de un gen constitutivo (gen de referencia) cuya expresión no varía bajo las condiciones experimentales.

El uso de este método asume que la eficiencia de amplificación es la misma para todas las muestras, lo que implica una optimización previa de la PCR.

Para analizar cambios relativos en la cantidad de transcritos, se elige como patrón un transcrito de referencia que no varíe su expresión en los tratamientos bajo estudio. Comparando los Ct del gen de referencia con el gen de interés en muestras tratadas y sin tratar, se pueden determinar cambios relativos en la expresión del gen de interés.

Aplicaciones de la PCR en Tiempo Real

• Estudio de virus, investigación de bacterias y hongos patógenos.
• Identificación de mutaciones o polimorfismos.
• Investigación de cambios en la expresión génica.
• Ventaja: Requiere una cantidad mínima de muestra para la amplificación.
• Investigación forense y bioseguridad.
• Seguridad alimentaria.