Fundamentos y Aplicaciones de Inmunofluorescencia, RIA y Técnicas Inmunoenzimáticas

Técnicas de Inmunofluorescencia

La inmunofluorescencia es una técnica crucial para:

• La identificación y localización de moléculas (antígenos, Ag) en secciones de tejidos, células o fluidos biológicos.
• La determinación de anticuerpos específicos.

Método General

Se basa en el uso de anticuerpos (Ig) específicos, a menudo anti-especie, que están conjugados con fluorocromos o que son detectados mediante un sistema que involucra fluorocromos.

Fluorocromo

Los fluorocromos son moléculas que, al ser irradiadas con energía electromagnética de una longitud de onda específica (luz de excitación), absorben esta energía y luego emiten una radiación detectable de una longitud de onda característica, generalmente más larga (luz de emisión o fluorescencia).

Microscopio de Epifluorescencia

El proceso en un microscopio de epifluorescencia es el siguiente:

1. La luz de una fuente (ej. lámpara de mercurio o LED) atraviesa un primer filtro (filtro de excitación) que selecciona la longitud de onda adecuada para excitar al fluorocromo específico utilizado.
2. Esta luz de excitación se refleja en un espejo dicromático (o dicroico) y se dirige hacia la muestra, incidiendo sobre ella y excitando al fluorocromo presente en el complejo antígeno-anticuerpo.
3. La luz emitida por la fluorescencia de la muestra, junto con la luz de excitación reflejada, es recogida por el objetivo. Ambas atraviesan el espejo dicromático; el espejo permite el paso de la luz emitida (de mayor longitud de onda) pero refleja la luz de excitación restante.
4. La luz emitida llega a un segundo filtro (filtro de barrera o de emisión) que selecciona únicamente la longitud de onda de emisión del fluorocromo, bloqueando cualquier luz de excitación residual u otra fluorescencia no específica.
5. Finalmente, la luz de fluorescencia filtrada puede ser observada directamente a través de los oculares o ingresar en un detector, como un fotomultiplicador o una cámara CCD, que la convierte en una señal eléctrica o digital, permitiendo su visualización, análisis y cuantificación.

Inmunofluorescencia Directa (IFD)

Objetivo: Identificación de un antígeno (Ag) problema en una muestra.

Componentes Clave en IFD:

• Elemento problema: Antígenos (Ag) que se sospecha están presentes, usualmente fijados a un soporte sólido (portaobjetos).
  • Tipos de Antígenos (Ag): Pueden ser componentes de células, secciones de tejidos, bacterias, hongos, virus, etc.
  • Tipos de Muestras: Frotis celulares, improntas de tejidos, cortes de tejido congelado o fijado, cultivos celulares, etc.
• Elemento conocido: Un anticuerpo (Ac) específico que reconoce al antígeno a identificar, y que está directamente conjugado (marcado) con un fluorocromo.

Proceso de IFD:

1. Incubación: La muestra con el posible antígeno se incuba con el anticuerpo marcado con fluorocromo. Si el antígeno está presente, el anticuerpo se unirá formando inmunocomplejos específicos.
2. Lavado: Se realizan lavados para eliminar los anticuerpos marcados que no se unieron específicamente al antígeno, quedando solo aquellos unidos al objetivo.
3. Observación: La muestra se observa bajo un microscopio de fluorescencia. La presencia y localización de fluorescencia específica indican la presencia y ubicación del antígeno en la muestra.

Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)

Objetivo: Detección de un antígeno (Ag) o un anticuerpo (Ac) problema.

Elementos Reaccionantes en IFI:

• Para detección de Antígeno problema:
  1. Antígeno (Ag) problema (presente en la muestra).
  2. Anticuerpo primario (Ac 1º): Es un anticuerpo no marcado, específico contra el Ag problema.
  3. Anticuerpo secundario (Ac 2º): Es un anticuerpo marcado con un fluorocromo, específico contra la especie del anticuerpo primario (ej. anti-IgG de ratón si el Ac 1º fue producido en ratón).
• Para detección o cuantificación de Anticuerpo problema (ej. en suero):
  1. Antígeno (Ag) conocido: Se fija a un soporte sólido (ej. células o tejidos en un portaobjetos).
  2. Anticuerpo primario (Ac 1º): Es el anticuerpo problema que se busca en la muestra biológica (ej. autoanticuerpos en el suero de un paciente).
  3. Anticuerpo secundario (Ac 2º): Es un anticuerpo marcado con un fluorocromo, específico contra la especie e isotipo del anticuerpo problema (ej. anti-IgG humana si se buscan anticuerpos IgG en suero humano).

Ventaja de IFI sobre IFD:

Una ventaja significativa de la IFI es la amplificación de la señal, ya que múltiples moléculas de anticuerpo secundario marcado pueden unirse a una sola molécula de anticuerpo primario. Además, ofrece mayor versatilidad, ya que un mismo anticuerpo secundario conjugado puede usarse para detectar diferentes anticuerpos primarios (siempre que estos sean de la misma especie y tipo).

Proceso Típico de IFI para Cuantificación/Detección de Anticuerpos en Suero:

1. Se prepara un sustrato con el antígeno conocido (ej. células o tejido fijado en un pocillo o portaobjetos).
2. Se añade el suero problema diluido (que puede contener el anticuerpo específico a detectar).
3. Incubación y lavado: Se incuba para permitir la unión del anticuerpo problema (si está presente) al antígeno. Luego se lava para eliminar los componentes del suero no unidos.
4. Se añade el anticuerpo secundario conjugado con fluorocromo (ej. anti-IgG humana marcada).
5. Incubación y lavado: Se incuba para permitir la unión del conjugado al anticuerpo problema unido al antígeno. Luego se lava para eliminar el exceso de conjugado no unido.
6. Observación y/o Medición: Se examina la muestra en el microscopio de fluorescencia. La presencia e intensidad de la fluorescencia pueden indicar la presencia y, a veces, el título (concentración relativa) del anticuerpo en el suero.

Radioinmunoanálisis (RIA)

El Radioinmunoanálisis (RIA) es una técnica de inmunoensayo de alta sensibilidad utilizada para la cuantificación de antígenos (Ag) o anticuerpos (Ac) problema en muestras biológicas.

Método

Se basa en la competencia entre un antígeno (o anticuerpo) marcado con un isótopo radiactivo y el antígeno (o anticuerpo) no marcado presente en la muestra problema, por un número limitado de sitios de unión de un anticuerpo (o antígeno) específico. La detección de los inmunocomplejos formados se realiza midiendo la radiactividad.

Marcadores Radiactivos Utilizados:

• Isótopos emisores de radiaciones gamma (γ) de baja energía, como el ¹²⁵I (Yodo-125).
• Isótopos emisores de radiaciones beta (β), como el ³H (Tritio) o ¹⁴C (Carbono-14).

Sistema de Detección:

• Contador de centelleo: Mide la radiactividad emitida por la muestra. Se utiliza un contador gamma para emisores gamma o un contador de centelleo líquido para emisores beta.

Ventajas del RIA:

• Alta sensibilidad analítica: Capaz de detectar concentraciones muy bajas de analitos.
• Amplio uso histórico: Especialmente en la cuantificación de hormonas, proteínas séricas, fármacos y vitaminas.
• Técnica relativamente no complicada en su ejecución una vez estandarizada.
• Puede ser rápida en la obtención de resultados para grandes lotes de muestras.

Desventajas del RIA:

• Costo: Los reactivos radiactivos y el equipo de detección pueden ser caros.
• Vida media corta de los isótopos: Los marcadores radiactivos tienen una vida media limitada, lo que afecta la estabilidad y vida útil de los kits.
• Riesgos para la salud y el medio ambiente: Implica el manejo de material radiactivo, con los consiguientes protocolos de seguridad, y la necesidad de una gestión adecuada de los residuos radiactivos.

Modalidades del RIA

RIA Indirecto (Para Cuantificación de Anticuerpos)

Este enfoque se utiliza para medir la concentración de anticuerpos específicos en una muestra.

Pasos principales:

1. Un antígeno (Ag) conocido se fija a una fase sólida (ej. la superficie de tubos o pocillos de una placa).
2. Se añade la muestra de suero (u otro fluido biológico) que contiene el anticuerpo (Ac) problema a cuantificar. Se permite la incubación para que el anticuerpo se una al antígeno.
3. Lavado: Para eliminar los componentes de la muestra no unidos.
4. Se añade un anticuerpo secundario (anti-inmunoglobulina de la especie del Ac problema) marcado con un isótopo radiactivo. Este anticuerpo secundario se unirá al anticuerpo problema que ha sido capturado por el antígeno en la fase sólida.
5. Incubación y lavado: Para permitir la unión del anticuerpo secundario marcado y eliminar el exceso no unido.
6. Lectura de la radiactividad: Se mide la radiactividad de la fase sólida. La cantidad de radiactividad detectada es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpo problema presente en la muestra original.

RIA Directo/Competitivo o de Captura (Para Cuantificación de Antígenos)

Esta modalidad se utiliza para la cuantificación de antígenos. En un formato competitivo típico, el antígeno de la muestra compite con una cantidad conocida de antígeno marcado radiactivamente por un número limitado de sitios de unión de un anticuerpo específico. Cuanto más antígeno haya en la muestra, menos antígeno marcado se unirá, y viceversa.

Técnicas Inmunoenzimáticas (EIA / ELISA)

Las técnicas inmunoenzimáticas, como el conocido ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) o EIA (Enzyme Immunoassay), son métodos de inmunoanálisis que detectan y/o cuantifican uniones primarias antígeno-anticuerpo (Ag-Ac) mediante el empleo de enzimas como marcadores inmunoquímicos.

Principio

En estas técnicas, una enzima se conjuga covalentemente a un antígeno o a un anticuerpo. Esta enzima, al reaccionar con un sustrato específico, cataliza una reacción que produce un cambio medible, como un cambio de color, fluorescencia o quimioluminiscencia.

Reacción Enzimática y Detección

Cuando la enzima conjugada se combina con un sustrato adecuado, origina una reacción observable:

• Sustrato cromogénico: La enzima convierte el sustrato en un producto coloreado. La intensidad del color, medida espectrofotométricamente, es proporcional a la cantidad de Ag o Ac presente. Esta es la base de la reacción colorimétrica.
• Otros sustratos pueden generar productos fluorescentes (detectados por fluorometría) o quimioluminiscentes (detectados por luminometría), ofreciendo a menudo mayor sensibilidad.

Aplicaciones

Las técnicas inmunoenzimáticas son ampliamente utilizadas para la detección y/o cuantificación de una gran variedad de analitos, incluyendo antígenos (como proteínas, hormonas, marcadores tumorales, componentes microbianos) y anticuerpos (como los generados en respuesta a infecciones o en enfermedades autoinmunes) en diversas muestras biológicas.