Fundamentos y Aplicaciones de la Ingeniería Genética: Técnicas Moleculares Esenciales

1. Secuenciación del ADN

La secuenciación del ADN comprende el conjunto de técnicas que han permitido conocer la secuencia exacta de nucleótidos del ADN. Este logro se ha alcanzado en diversas especies, incluyendo bacterias, Drosophila, y, notablemente, en el genoma humano.

2. Formación de Moléculas de ADN Recombinante

Se denomina ADN recombinante a las moléculas de ADN que resultan de la unión de un gen de interés y un vector adecuado para su transporte. Este proceso se realiza en tres etapas fundamentales:

1. Corte de Fragmentos de ADN

   Las endonucleasas de restricción son enzimas bacterianas cuya misión original es destruir el ADN procedente de bacteriófagos. Tienen la propiedad crucial de cortar el ADN solo en ciertas secuencias específicas de nucleótidos. Cada tipo de endonucleasa (proveniente de bacterias diferentes) corta por un lugar distinto, actuando como verdaderas tijeras moleculares. Así se forman fragmentos con extremos cohesivos.

2. Separación de los Fragmentos de ADN

   La separación se realiza mediante electroforesis. Se aplica un campo eléctrico a la mezcla y los fragmentos se separan a través de un gel en función de sus tamaños, originando diferentes bandas.

3. Unión al Vector

   Los vectores son moléculas de ADN transportadoras. Suelen ser plásmidos bacterianos o genomas víricos. La unión del fragmento de ADN al vector se realiza mediante la enzima ADN ligasa. A las moléculas resultantes se les llama ADN recombinante.

3. Síntesis de ADN Complementario (ADNc)

El ADNc (o ADN complementario) es una secuencia de ADN sintetizada artificialmente utilizando como molde el ARN mensajero (ARNm), mediante la enzima transcriptasa inversa. Su principal ventaja es que no contiene intrones, ya que se sintetiza a partir de un ARNm maduro.

4. Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)

La PCR es una técnica que permite conseguir muchas copias de un fragmento de ADN, incluso si la cantidad inicial en la muestra es muy escasa. El número de copias aumenta exponencialmente en cada ciclo de síntesis.

Componentes esenciales para la PCR:

• Una cadena molde (la muestra de ADN).
• Una mezcla de desoxirribonucleótidos trifosfato.
• Un cebador (pequeño fragmento de ADN monocatenario).
• Una ADN polimerasa termoestable.

El proceso está totalmente automatizado. Las polimerasas utilizadas se obtienen de bacterias termófilas (como la Taq polimerasa), ya que se requieren temperaturas elevadas durante el proceso (especialmente al inicio, para desnaturalizar el fragmento de ADN y separar las dos hebras de la doble hélice).

Aplicaciones de la PCR:

Esta técnica tiene amplias aplicaciones en campos como la arqueología, la paleontología y la medicina forense.

5. Clonación de Genes

Clonar un gen consiste en obtener un conjunto de numerosas copias idénticas de ese gen. El proceso se divide en las siguientes etapas:

1. Aislamiento y Obtención del Gen

   Se realiza mediante el uso de endonucleasas de restricción.

2. Selección del Vector de Clonación

   Los vectores de clonación suelen ser plásmidos o genomas víricos. Es crucial que los vectores porten otros genes, denominados marcadores, que permitirán identificar las células que contienen el vector de clonación insertado.

3. Formación del ADN Recombinante

   Se lleva a cabo mediante la enzima ADN-ligasa.

4. Inclusión del ADN Recombinante en una Célula Hospedadora

   Se deben utilizar células con una rápida multiplicación. Para introducir el ADN en células vivas se emplean varios métodos, dependiendo del tipo celular:

   En Células Procariotas (Bacterias):

   • Transformación: Las células introducen el ADN directamente desde el exterior.
   • Transducción: El ADN se introduce mediante un virus bacteriófago.

   En Células Eucariotas:

   Células Vegetales:

   Se suele usar el plásmido Ti de la bacteria patógena Agrobacterium tumefaciens. Esta bacteria introduce el plásmido Ti en la célula vegetal para producir tumoraciones. Previamente, se eliminan del plásmido los genes responsables de su poder patógeno y se sustituyen por el gen de interés (por ejemplo, genes de resistencia a enfermedades o de mayor productividad).

   Células Animales:

   • Microinyección: Se realiza mediante un capilar muy fino (aproximadamente 1,5 micras de diámetro).
   • Pistola de genes: Dispara microproyectiles revestidos de ADN al interior de células animales o vegetales.

5. Comprobación y Selección

   Se comprueba la expresión del gen clonado y se seleccionan las células hospedadoras que lo portan (bacterias o células eucariotas). Esto puede hacerse de varias maneras:

   • Detectando la proteína producto del gen de interés.
   • Mediante marcadores (por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos en bacterias).
   • Mediante una sonda radiactiva (una cadena de ADN marcada radiactivamente que es complementaria a una de las hebras del gen clonado).