Fundamentos y Aplicaciones del Cultivo Celular y de Tejidos en el Laboratorio

Técnicas de Cultivo en Biología Celular

1. Cultivo de Órganos

Consiste en mantener un órgano entero o parte de él en la interfase entre un medio de cultivo artificial y una atmósfera controlada. Se dispone el órgano sobre una rejilla situada en una interfase líquido-gas que permite la nutrición y la eliminación de desechos.

• Una de las ventajas es que se conserva la arquitectura característica del tejido “in vivo”; aun así, la proliferación y el crecimiento celular es escaso y está muy limitado.
• Únicamente se produce crecimiento de algunas células indiferenciadas o embrionarias presentes en los tejidos, fundamentalmente en la zona periférica, que no conservan la estructura tisular típica del órgano.
• Como ejemplos podemos hablar de cultivos de ganglios, fragmentos hepáticos o de piel.
• Se utilizan para estudiar interacciones y relaciones intercelulares, respuestas globales a estímulos y sustancias, etc.

2. Cultivos de Explantes

Fragmentos de tejido vivos o explantes que también se pueden cultivar. Consiste en adherir un fragmento de tejido a una superficie (placa o frasco de cultivo) y nutrirlo con un medio de cultivo.

• Las células de la periferia del explante se multiplican, proliferan y migran a la superficie del soporte.
• Ejemplo: tejidos epiteliales.

3. Cultivos de Células

Se realizan a partir de suspensiones celulares introducidas en un recipiente con un medio de cultivo determinado en condiciones óptimas. Según la procedencia de la suspensión, distinguimos:

• Cultivo celular primario: la suspensión celular de partida se obtiene disgregando las células por métodos enzimáticos o mecánicos. De ello se obtiene una mezcla celular compleja formada por distintos tipos celulares presentes en el tejido. El cultivo se puede realizar a partir de esta mezcla seleccionando un tipo celular concreto.
• Cultivo celular secundario: la suspensión celular de partida se obtiene a partir de un cultivo primario o de otro cultivo secundario mediante un subcultivo o “pase”.
• Muestras de partida: cualquier tipo de tejido, sangre periférica, células hematopoyéticas, células madre.

2. Curva de crecimiento de los cultivos

La curva de crecimiento es la representación gráfica del crecimiento de las células en un cultivo a lo largo del tiempo, una vez se han depositado en el recipiente adecuado y con las condiciones óptimas. Se identifican 4 fases:

1. Fase de latencia: en ella se produce la adaptación de las células al cultivo. No hay crecimiento, por lo que es un tramo recto sin pendiente; corresponde a las primeras 24 horas. Algunas células no se adaptarán y morirán; otras células sí lo harán, comenzando a proliferar y consecuentemente pasando a la siguiente fase.
2. Fase exponencial: aumento exponencial del número de células hasta alcanzar un máximo, tramo con pendiente elevada, dura aproximadamente 6-7 días. Ocurre porque en el medio hay disponibilidad de espacio y una alta concentración de nutrientes.
3. Fase estacionaria: tramo de meseta, ocurre a partir de los 6-7 días de evolución del cultivo, el número de células permanece constante. Al aumentar tan rápidamente el número de células en la fase exponencial, comienzan a disminuir los nutrientes y a escasear el espacio, además aumentan los desechos celulares tóxicos. Debido a todo ello, las células comienzan a morir y se iguala el número de nacimientos con el número de muertes, por lo que el número total de células en el cultivo se mantiene constante.
4. Fase de declinación: también se denomina fase de muerte del cultivo, debido a que aumenta significativamente la tasa de mortalidad celular respecto al nacimiento. Se produce la senescencia del cultivo, los desechos siguen acumulándose y hay déficit de nutrientes.

3. Formas de Crecimiento

El crecimiento puede ser: en monocapa y en suspensión.

Crecimiento en monocapa

• En él las células crecen adheridas sobre una superficie sólida de plástico o vidrio.
• Este tipo de células son dependientes de anclaje: necesitan adherirse a una superficie sólida para poder crecer.
• Es el método utilizado para el cultivo de la mayoría de las células.

Se pueden distinguir diferentes momentos de desarrollo:

1. Adhesión a una superficie: período durante el cual las células se adhieren al soporte. Coincide con el período de latencia de la curva de crecimiento.
2. Proliferación y formación de colonias: cuando las células se han pegado a la pared del frasco de cultivo, empiezan a proliferar expandiéndose por toda la superficie y formando colonias celulares. Esta fase corresponde con la fase exponencial de crecimiento.
3. Inhibición por contacto: con el paso del tiempo las células ocupan toda la superficie disponible y entran en confluencia estableciendo contactos entre ellas. En este momento se produce un fenómeno denominado inhibición por contacto en el que las células detienen su crecimiento, aunque se mantienen vivas. Se inicia la fase estacionaria.

Para que las células reanuden su crecimiento se necesita hacer un subcultivo o “pase” de parte de las células en el nuevo frasco de cultivo. El momento ideal para hacerlo es al final de la fase exponencial.

Crecimiento en suspensión

• En este caso las células no necesitan adherirse a una superficie para crecer, por lo que se mantienen dispersas en el seno del medio de cultivo y proliferando.
• Es un crecimiento característico de: células sanguíneas circulantes, células hematopoyéticas, células madre y algunas líneas tumorales.

Podemos distinguir las siguientes fases:

1. Adaptación al medio de cultivo (fase de latencia).
2. Proliferación en suspensión (fase exponencial).
3. Inhibición por densidad (fase estacionaria): momento en el que se alcanza un número celular crítico en relación con el volumen del medio de cultivo y de los nutrientes que quedan en él. En este momento es necesario hacer un pase para que el crecimiento se reanude.

4. Comportamiento vital tras sucesivos pases

Los sucesivos pases a partir del cultivo primario dan origen a una línea celular primaria o a una línea celular continua.

Línea celular primaria (línea finita)

• Es aquella obtenida a partir de un tejido u órgano mediante un cultivo primario y que se mantiene en cultivo mediante pases seriados durante un tiempo limitado.
• La población celular aumenta en cada pase y normalmente a partir del tercer pase se estabiliza.
• Esto significa que las células se hacen uniformes y homogéneas; las características morfológicas y fisiológicas son estables durante las sucesivas generaciones.
• Senescencia: las líneas celulares primarias tienen una vida finita. La fase de senescencia es la etapa vital en la que las células van perdiendo su capacidad de dividirse y el cultivo acaba muriendo; esto es debido a que tras sucesivas divisiones las células van acumulando anomalías genéticas y perdiendo funciones.

Se puede conservar una línea celular primaria congelando células antes de alcanzar la senescencia en los primeros pasos.

Línea celular continua

Se obtienen a partir de un cultivo primario y se mantienen en cultivo por tiempo ilimitado mediante pases sucesivos. Están formadas por células que se diferencian genética y morfológicamente de las células de las cuales se originaron.

• Pueden provenir de tumores o de un proceso de transformación de un cultivo primario por medio de una pérdida de regulación debido al subcultivo continuo.
• Aparecen espontáneamente en algunos cultivos que se mantienen durante más de lo esperado, debido a la aparición de células inmortales capaces de originar una línea estable y permanente.
• También pueden inducirse mediante transfección con oncogenes o el tratamiento con agentes carcinogénicos.

Las células transformadas tienen las siguientes características:

• Crecen indefinidamente en cultivo, son inmortales.
• Pierden la dependencia del anclaje para crecer, por lo que pueden crecer en suspensión.
• Pierden la inhibición por contacto.
• Pueden invadir tejidos y producir tumores.
• Acumulan anomalías genéticas, normalmente son aneuploides, con múltiples aberraciones cromosómicas.

5. Medios de Cultivo

El cultivo celular se realiza en medios artificiales preparados que contienen una mezcla de componentes purificados o soluciones complejas. Los factores que hay que tener en cuenta son:

1. Soporte Físico

• Recipientes de vidrio: fáciles de limpiar y esterilizar; permiten la observación directa al microscopio. Coste bajo.
• Recipientes de plástico: desechables y de bajo coste. Buena calidad óptica, es el soporte más común (placas multipocillo, placas de Petri, frascos Roux, botellas roller).
• Otros: poliacrilamida, metales, matrices tridimensionales (colágeno, celulosa).

2. Composición del Medio de Cultivo

• Soluciones salinas equilibradas: mezcla de sales inorgánicas como NaCl, KCl, NaHCO₃, CaCl₂, MgCl₂, etc.
• Aminoácidos: se debe suplementar con los aminoácidos esenciales y otros requeridos.
• Vitaminas: como biotina y riboflavina. Son factores limitantes.
• Glucosa: fuente de energía principal.
• Hormonas y factores de crecimiento: lo más común es el suero bovino fetal (FBS).
• Inhibidores de microorganismos: antibióticos y antimicóticos.
• Solución tampón: bicarbonato sódico para evitar cambios bruscos de pH.
• Indicador de pH: rojo fenol.

3. Características Físico-Químicas y Atmósfera Gaseosa

• Concentración de O₂: depende del tipo celular. Los cultivos de órganos pueden requerir saturación de oxígeno.
• Concentración de CO₂: influye en el pH en equilibrio con el ión bicarbonato.
• Temperatura: gran influencia en la tasa de crecimiento. Las células de mamíferos crecen óptimamente a 37ºC.
• pH: el valor óptimo es el fisiológico (pH=7,4). Se utiliza el rojo fenol como indicador visual.
• Osmolaridad: se emplean medios ligeramente hipotónicos o isotónicos para compensar la evaporación y mantener las células hidratadas.
• Humedad: debe ser elevada para evitar pérdidas por evaporación.

6. Citometría de Flujo (CMF)

Técnica de análisis celular multiparamétrico basada en hacer pasar una suspensión de células por un haz de luz (láser), midiendo la dispersión de la luz y/o fluorescencia. Permite obtener información sobre tamaño, estadio de diferenciación y características antigénicas.

Ventajas:

• Análisis de un elevado número de células en corto periodo de tiempo (5000 células/segundo).
• Gran sensibilidad y precisión para detectar enfermedades residuales o poblaciones escasas (basófilos).
• Almacenamiento informático de datos.

Inconveniente: requiere células en suspensión, perdiendo la información de la arquitectura tisular.

8. Aplicaciones del Cultivo Celular

Determinación de microorganismos infecciosos

Es la técnica con mejores resultados para identificar el microorganismo causante de una infección mediante medios selectivos y técnicas de biología molecular.

Diagnóstico citogenético postnatal

Se utilizan muestras de sangre periférica (serie blanca), biopsias de piel o gónadas.

• Cultivo de sangre periférica: requiere de 1 a 5 ml de muestra con heparina sódica. Debe procesarse en las primeras 24 horas.
• Se utiliza lecitina nitrogenada (fitohemaglutinina) para estimular la proliferación de glóbulos blancos.
• Incubación a 37ºC durante 72 horas en posición horizontal.

Diagnóstico citogenético prenatal

• Líquido amniótico: mediante amniocentesis (técnica invasiva, riesgo de aborto 0,2-0,5%). Se requieren unos 20ml.
• Biopsia de vellosidades coriónicas: vía transcervical. Riesgo de aborto 0,5-1%.
• Sangre fetal de cordón umbilical: por cordocentesis. Riesgo muy elevado, poco usada.

Diagnóstico oncológico

A partir de sangre periférica, médula ósea, ganglios linfáticos o biopsias de tumores, siguiendo los protocolos de cultivo descritos.

9. Ventajas e Inconvenientes del Cultivo Celular

Ventajas:

• Control preciso del ambiente: factores fisicoquímicos y biológicos controlados.
• Homogeneidad de las muestras: las células son clones genéticamente idénticos.
• Economía: bajo gasto de reactivos comparado con el uso de animales completos.
• Motivaciones éticas: alternativa al uso de animales de laboratorio.

Inconvenientes:

• Escasa producción: la concentración final de células es baja.
• Técnica sensible: crecimiento lento y alta susceptibilidad a contaminación (bacterias/hongos). Requiere asepsia estricta.
• Pérdida de estructura tridimensional: la disgregación elimina las interacciones espaciales y puede conllevar pérdida de funciones.

Respuestas del Cuestionario

2) C "vida finita" | 3) A "latencia" | 4) A | 5) D | 6) D | 7) B "senescencia" | 8) D "bicarbonato sódico" | 9) A "vitaminas" | 10) C "37º" | 11) B | 12) C | 13) D | 14) C