Fundamentos de Ácidos Nucleicos y Técnicas de Biología Molecular

Conceptos Fundamentales y Técnicas en Ácidos Nucleicos

1. Define ácidos nucleicos:

Son macromoléculas poliméricas encargadas de almacenar, transmitir y expresar la información genética de los seres vivos.

2. Enumera los componentes básicos de un nucleótido:

Un nucleótido está compuesto por: una base nitrogenada, una pentosa (ribosa en el ARN o desoxirribosa en el ADN) y una molécula de ácido fosfórico (en forma de anión fosfato).

3. Extremos de la cadena de nucleótidos:

El extremo 5' (cinco prima), con un grupo fosfato unido al carbono 5' (C5') de la pentosa del primer nucleótido, y el extremo 3' (tres prima), con un radical hidroxilo (-OH) unido al carbono 3' (C3') de la pentosa del último nucleótido.

4. ¿Qué es la renaturalización del ADN?:

Al disminuir la temperatura lentamente o bajar el pH hasta valores neutros, se vuelven a formar los puentes de hidrógeno entre las bases complementarias, y la molécula de ADN recupera su conformación nativa en doble hélice. Este proceso se denomina renaturalización.

6. ¿Qué significa que las cadenas de una molécula de ADN son antiparalelas?:

Significa que los enlaces fosfodiéster 5'-3' están orientados en sentidos opuestos, de manera que el extremo 5' de una cadena se enfrenta al extremo 3' de la otra.

7. ¿Qué es el ADN copia (ADNc)?:

Es un tipo de ADN especial obtenido in vitro. No existe como tal en la naturaleza; se obtiene en el laboratorio a partir de ARN mensajero (ARNm) aislado de una célula, mediante la enzima transcriptasa inversa.

8. Describe los lazos que forma la molécula de ARNt:

La molécula de ARN de transferencia (ARNt) forma varios lazos característicos:

• Lazo D (dihidrouridina): Es el sitio de unión de la enzima aminoacil-ARNt sintetasa, encargada de unir el aminoácido correspondiente al extremo 3' del ARNt.
• Lazo TΨC (o lazo T): Es el sitio de unión al ribosoma.
• Lazo anticodón: Contiene el anticodón, una secuencia de tres bases complementarias al codón en el ARNm que codifica para el aminoácido que porta el ARNt.

9. ¿Dónde comienza la replicación del ADN?:

La replicación del ADN comienza en puntos de iniciación concretos denominados orígenes de replicación.

• En el cromosoma bacteriano (procariotas), generalmente hay un único origen de replicación.
• En los cromosomas eucariotas, existen múltiples orígenes de replicación, por lo que la replicación se inicia de manera simultánea en varios puntos de cada cromosoma.

10. ¿Qué función tienen las proteínas SSB (Single-Strand Binding proteins) en la replicación del ADN?:

Las proteínas SSB (proteínas de unión a cadena sencilla) se unen a las cadenas de ADN desenrolladas (cadenas sencillas), evitando que se vuelvan a aparear y formar la doble hélice, y protegiéndolas de la degradación por nucleasas.

11. ¿Qué ocurre en la fase de elongación de la transcripción del ADN a ARN?:

La fase de elongación de la transcripción consiste en la adición secuencial de ribonucleótidos catalizada por la ARN polimerasa. De las dos cadenas de la molécula de ADN, solo una de ellas (la cadena molde) se transcribe para formar la molécula de ARN.

12. Enumera las características del código genético:

El código genético es:

• Universal: Es prácticamente el mismo en todos los seres vivos (con algunas excepciones).
• No es ambiguo: Cada codón especifica un único aminoácido.
• Degenerado (o redundante): Varios codones pueden codificar para el mismo aminoácido.
• Continuo y no solapado: Se lee de forma continua, sin comas ni superposiciones entre codones.

14. ¿Qué necesita una ADN polimerasa para realizar su función?:

Una ADN polimerasa necesita:

• Los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
• Una cadena de ADN molde.
• Cebadores (primers) de ARN o ADN, que proporcionan un extremo 3'-OH libre.
• Iones Mg²⁺ como cofactor.

15. Enumera las fases del protocolo técnico para la obtención de ácidos nucleicos (AN) purificados:

• Pretratamiento de la muestra.
• Extracción de los ácidos nucleicos.
• Purificación de los ácidos nucleicos.

16. Enumera los pasos a seguir en un pretratamiento habitual de una muestra de sangre (para extracción de ADN de leucocitos):

• Lisis de los hematíes (glóbulos rojos).
• Centrifugación de la muestra (para sedimentar los leucocitos).
• Eliminación del sobrenadante.
• Conservación del sedimento (pellet de leucocitos).

17. ¿En qué consiste la homogeneización química de un tejido vegetal?:

Consiste en someter el tejido a la acción de proteasas y detergentes que degradan los componentes tisulares, disgregando las células y facilitando la liberación de los ácidos nucleicos.

18. Cita los procesos que comprende la extracción de ácidos nucleicos (AN):

• Lisis celular: Para liberar los ácidos nucleicos del interior de las células.
• Inactivación de nucleasas celulares: Para evitar la degradación de los ácidos nucleicos por estas enzimas.

19. ¿Cómo se consigue purificar el ADN por medio de una cromatografía de intercambio iónico?:

Se basa en la unión electrostática reversible de los ácidos nucleicos (cargados negativamente debido a los grupos fosfato) a grupos funcionales cargados positivamente, unidos covalentemente a una fase estacionaria. Para purificar AN, se usan matrices de sílice o celulosa empaquetadas en columnas (generalmente de polipropileno), a las cuales se une covalentemente un intercambiador aniónico (que retiene los aniones, como el ADN).

20. ¿Cómo se realiza un lavado de ADN (en precipitación con etanol)?:

Una vez eliminado el sobrenadante después de la precipitación, el pellet de ADN se lava con etanol al 70-95% frío. Esto ayuda a eliminar sales y otros contaminantes solubles en etanol. Posteriormente, se vuelve a centrifugar para sedimentar el ADN y descartar el etanol de lavado.

21. ¿Qué tratamientos habrá que realizar para extraer ADN de células con pared celular (ej. bacterias, hongos, plantas)?:

• Tratamiento enzimático: Uso de enzimas específicas para degradar la pared (ej. lisozima para bacterias, celulasas/pectinasas para plantas, quitinasas para hongos).
• Tratamiento mecánico: Métodos físicos como sonicación, molido con nitrógeno líquido, uso de perlas de vidrio (bead beating).
• Tratamiento con CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio): Un detergente catiónico que ayuda a lisar células y precipitar ácidos nucleicos, especialmente útil en plantas.

22. ¿Cómo se resuspenden los ácidos nucleicos (AN) obtenidos en un proceso de purificación por esferas magnéticas?:

Los AN eluídos de las esferas magnéticas se resuspenden en agua destilada libre de nucleasas o en un tampón de baja fuerza iónica a pH neutro o ligeramente alcalino, como el tampón TE (Tris-EDTA).

23. ¿Qué se consigue con una neutralización rápida dentro del proceso de purificación de ADN plasmídico por el método de lisis alcalina?:

Una neutralización rápida (generalmente con acetato de potasio) tras la lisis alcalina produce dos efectos principales sobre los componentes de la mezcla:

• Renaturalización selectiva del ADN plasmídico: Las pequeñas moléculas de ADN plasmídico circular superenrollado pueden renaturalizar rápidamente sus cadenas complementarias.
• Precipitación del ADN genómico y proteínas desnaturalizadas: El ADN genómico, más grande y que puede estar linealizado o fragmentado, no renaturaliza eficientemente y precipita junto con proteínas desnaturalizadas y complejos de dodecilsulfato de potasio (KDS).

24. ¿Qué significado tiene la aparición de un smear (barrido o estela) en una electroforesis en gel de agarosa de ADN genómico?:

• Idealmente, el ADN genómico intacto de alta calidad debería migrar como una banda única y bien definida en la parte superior del gel (debido a su gran tamaño).
• Si el ADN está fragmentado o degradado, en lugar de una banda nítida, aparece una estela fluorescente o smear que se extiende hacia pesos moleculares menores. Un smear indica degradación del ADN.