Extracción de Biomoléculas: Técnicas y Optimización para PCR

Fuentes de biomoléculas: Se pueden obtener de diversos organismos, incluyendo animales (tejido, sangre, espermatozoides), vegetales (tejido foliar, ramas (corteza-floema), raíz, semillas, microalgas, diatomeas), hongos y bacterias (en cultivo o in situ), así como de muestras de agua salada, dulce, salobre, cianobacterias y tierra.

Sustancias Inhibidoras de la PCR

Es crucial considerar la presencia de sustancias inhibidoras de la PCR, tales como:

• Sales biliares (heces)
• Polisacáridos complejos (heces, material vegetal)
• Colágeno (tejidos)
• Grupo hemo (sangre)
• Ácidos húmicos (suelo, material vegetal)
• Melanina y eumelanina (pelo, piel)
• Mioglobina (tejido muscular)
• Proteinasas (leche)
• Iones calcio (leche, huesos)
• Urea, hemoglobina, lactoferrina, inmunoglobulina G (sangre)

Anticoagulante: Heparina se utiliza como anticoagulante para el almacenamiento de sangre.

Reactivos comunes: Fenol (0.2), etanol (1), EDTA (0.5), NaCl (25mM), Acetato de Na (5mM), Urea (20).

Manipulación y Conservación de Muestras

Muestras animales, vegetales y de agua:

• Siempre refrigerar (4°C a -20°C) con algún preservante para corto y mediano plazo.
• Evitar la generación de hongos o bacterias de superficie.
• Prevenir la oxidación de las muestras (los metabolitos secundarios interfieren en reacciones moleculares enzimáticas).
• Evitar la degradación del ADN por nucleasas endógenas activas (actividad óptima a 37°C).

Largo plazo: Crioconservación (-80°C) o nitrógeno líquido (-150°C).

• Bacterias: en glicerol o DMSO al 5-30% (v/v).

Muestras Animales

Utilizar buffers de preservación como etanol 70%, etanol-EDTA, DMSO saturado (NaCl-EDTA) o RNA later (solución estabilizadora y protectiva del RNA y DNA).

Muestras Vegetales

Secar con silica gel o liofilizar. El rendimiento de extracción de ADN/ARN es moderado. Se obtienen mayores rendimientos con material fresco.

Consideraciones para la Extracción

El éxito, la fidelidad, la repetibilidad y la reproducibilidad del análisis (PCR) dependen de la calidad y cantidad del ADN aislado de una mínima cantidad de tejido o muestra.

Técnicas de análisis: PCR, RT-PCR, secuenciación Sanger, uso de enzimas de restricción, hibridación molecular, NGS.

Métodos de extracción: Se debe definir si se prioriza una alta concentración de ADN (pero impuro) o una baja concentración (pero purificado), considerando el tiempo del protocolo de extracción.

Métodos comunes:

• Fenol-Cloroformo:alcohol isoamílico (PCI)
• Sales orgánicas y detergentes
• Precipitación con isopropanol o etanol
• Extracción mediante sales (Salting out) o detergentes iónicos (CTAB)
• Kits comerciales
• Nitrógeno líquido
• Homogenizadores o morteros manuales

Pasos para la Extracción y Purificación de Ácidos Nucleicos

1. Disrupción del tejido y lisis celular.
2. Inactivación de nucleasas celulares liberadas tras la lisis.
3. Separación y recuperación de los ácidos nucleicos del resto del material celular.

Disrupción de Membranas Celulares

Bacterias en solución: Aisladas en medio de cultivo: Ebullición/Congelación.

Gram negativas: Choque alcalino.

Gram positivas: NaOH o SDS (Duodecil sulfato sódico).

Bacterias endógenas: Romper la membrana celular del huésped.

Disrupción de Tejidos Animales y Vegetales

Precauciones: Cuidado con ADNasas y ARNasas. Utilizar Thermo Scientific DNA AWAY™ / RNAasa AWAY y agua 0.1 % DEPC + autoclave.

1. Maceración en mortero de cerámica + buffer de extracción.
2. En condiciones normales: llevar el polvo con N2 líquido (-150°C).
3. Macerar con morteros en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml con o sin N2 líquido.
4. Macerar en tubos de microcentrífuga de 1.5 ml con aparatos especiales: desmembrador sónico, homogenizador de tejido manual, molino mecánico para muestras liofilizadas.

Extracción de Ácidos Nucleicos: Separación por Fases

Buffer de extracción/lisis:

• 0.01 M Tris (pH 7.8), 5 mM EDTA (pH 8) y 1.0 % SDS (pH 8.3) (β-mercaptoetanol o DTT).
• Sales de guanidina: inactivación de nucleasas.

Componentes del buffer:

• Tris (tris(hidroximetil)aminometano): Compuesto orgánico con capacidad tamponante a pH 7-9.2. Amortigua la fase acuosa.
• EDTA: Sal sódica derivada (agente quelante). Inhibe la DNAasa por secuestro de cationes divalentes (Mg++). Precipita metales que intervienen en la PCR.
• SDS: Compuesto tensoactivo iónico. Rompe enlaces no covalentes en proteínas (desnaturalización). Solubiliza membranas celulares. Pérdida de conformación nativa en proteínas.
• β-mercaptoetanol (2BME): Agente reductor que protege el ADN contra la actividad enzimática de peroxidasas y polifenoloxidasas. Antioxidante y desnaturalizante de estructuras proteicas (rompe puentes disulfuro).
• Proteinasa K (10 mg/ml): Endopeptidasa K (derivada de un hongo). Rompe polipéptidos asociados al ADN en unidades más pequeñas. Remueve nucleasas que degradan la fracción soluble de ácidos nucleicos.
• ARNasa: Se adiciona en el paso de re-suspensión o en el paso de lisis celular. Hidroliza el ARN y soporta el autoclave.

Importante: Evitar el pH óptimo de enzimas degradativas (DNAasa y RNAasa) pH 7.0. Utilizar soluciones tamponadas entre un pH 8-9.