Extracción de ácidos nucleicos: Métodos y consideraciones
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3. Extracción de ácidos nucleicos
Partimos de la suspensión celular obtenida en el pretratamiento.
Objetivo: conseguir una solución en la que los ácidos nucleicos se encuentran libres.
El proceso de extracción implica 2 procesos:
La lisis celular para liberar los ácidos nucleicos.
La inactivación de nucleasas celulares (ADNasa y ARNasa) para evitar la degradación.
Ambos procesos se consiguen mediante la incubación de la suspensión celular con una solución de lisis.
3.1 La solución de lisis
La composición de la solución de lisis depende del tipo de célula que se va a lisar. Puede incluir detergentes, EDTA, proteasas y agentes caotrópicos.
Detergentes
Los detergentes desestructuran la bicapa lipídica de las membranas y desnaturalizan las proteínas que hay en ella. El detergente más utilizado es el dodecil-sulfato-sódico (SDS).
EDTA
El EDTA es un quelante de cationes divalentes como el calcio y el magnesio. Mg2+: fundamental para la actividad de muchas enzimas. En consecuencia, al atrapar los cationes de magnesio que hay en el medio, el EDTA inhibe la actividad de las ADNasas.
Proteasas
Digestión de las proteínas de la membrana celular, facilitando la rotura y disolución de las membranas y eliminando las nucleasas.
Agentes caotrópicos
Son agentes que se encargan de inactivar las nucleasas. Desnaturalizan las macromoléculas impidiendo que realicen su actividad.
3.2 Tratamiento en células con pared celular
La presencia de pared celular en bacterias, levaduras, hongos y células vegetales dificulta la lisis celular. Para degradar esta pared son necesarios otros procesos o tratamientos: tratamiento enzimáticos, tratamientos mecánicos o químicos (CTAB).
Tratamiento enzimático
Para degradar la pared se suelen emplear enzimas específicas que digieren los componentes de la pared: Lisozima - Degrada la pared de bacterias. Líticasa - Degrada la pared de las células vegetales, levaduras y hongos.
Tratamiento mecánico
En este caso la pared celular se rompe mediante procesos mecánicos: sonicación, ciclos de congelación-descongelación, etc.
Tratamiento químico (CTAB)
Se utiliza una molécula denominada CTAB (bromuro de cetil-trimetilamonio), que facilita la eliminación de polisacáridos (abundantes en la pared celular) en el proceso de purificación.
3.3 Verificación del resultado de la lisis
Importante asegurarse que se ha conseguido una solución homogénea que indique que el proceso ha sido eficiente. Si la lisis celular no resulta suficiente, prolongar el protocolo hasta conseguir una homogeneización completa. *Homogénea: que no tenga grumos, cuerpos celulares…
3.4 Consideraciones en la extracción del ADN
Importante eliminar el ARN de la muestra extraída porque puede interferir en estudios posteriores. Uso de ARNasas - incubar a 37ºC 15-45 minutos.