Explorando la Microscopía Avanzada: Técnicas Confocales y de Dos Fotones para Investigación Biológica

Introducción a la Microscopía Avanzada

Las muestras pueden ser fijadas o no fijadas.

Se puede combinar con contraste de interferencia diferencial (DIC, Nomarski).

Aplicaciones y Alcance

Este sistema está orientado a:

• Estudio con muestras gruesas en fluorescencia (fijadas o no fijadas).
• Estudio de una muestra marcada con 1, 2, 3 o 4 moléculas fluorescentes al mismo tiempo.
• Realización de experimentos in vivo en células en cultivo con duración de tiempo variable.
• Reconstrucción tridimensional de especímenes gruesos estudiados en fluorescencia.
• Realización de experimentos in vivo en células en cultivo que requieren manejos complejos de áreas de estimulación para llevar a cabo técnicas de microscopía de fluorescencia avanzadas.

Funcionalidades Clave y Consideraciones

Aplicaciones Básicas:

• Obtención de imágenes marcadas con dos fluorocromos.
• Posibilidad de utilizar función de Zoom Digital (especialmente útil para aplicaciones del tipo FRAP, permitiendo una obtención muy rápida de imágenes).
• Ajuste electrónico de la magnificación y la resolución espacial del sistema.
• Visualización de células fluorescentes junto con contraste DIC (Nomarski) para observación de respuestas celulares.

¡Advertencia Importante!

La cantidad de luz que irradia a la muestra es proporcional al cuadrado del zoom.

Sistemas de Escaneo en Microscopía Confocal

Existen dos tipos principales de sistemas de escaneo:

1. Sistema con Filtro:

   • Trabaja con una longitud de onda específica.
   • No permite utilizar varios fluorocromos simultáneamente.
   • Es un sistema de cubos, diseñado para trabajar con los fluorocromos tradicionales más utilizados.
   • Ofrece alta eficiencia.

2. Sistema de Escaneo con Detector Espectral:

   • Mide una red de difracción.
   • Posee una mayor flexibilidad para detectar eventos pequeños o grandes de emisión.
   • Trabaja con fluorocromos complicados (que pueden hacer que el espectro se abra o se cierre).
   • Funciona como un espectrofluorómetro.
   • Utiliza una red de difracción para abrir linealmente el espectro.
   • Permite elegir el rango de detección deseado.
   • Facilita el trabajo con fluoróforos difíciles de separar con un sistema de filtros.

Características Destacadas del Olympus FV1000

• Twin Scanner: Permite medición y estimulación en forma simultánea.
• Excitación en Zona Específica: Con el FV1000, se obtiene imagen mientras se realiza el estímulo.

Microscopía Confocal de Disco Giratorio

Ideal para la observación en tiempo real de eventos celulares rápidos, ofreciendo alto rendimiento y minimizando el fotoblanqueamiento y la fototoxicidad.

Tecnologías en Microscopía Confocal de Disco Giratorio:

• Disco Nipkow: Tecnología clásica.
• Disco Ranurado (Slit Disk): Propiedad de Olympus.

Ambas tecnologías utilizan láser o lámparas de fluorescencia de alta eficiencia.

Detalles del Disco Ranurado (Slit Disk Confocal):

El disco contiene un patrón ranurado que crea una serie de pinholes virtuales mientras el disco gira a una gran velocidad (aproximadamente 3000 rpm). Rechaza la luz fuera de foco posicionando el disco giratorio con ranuras verticales y horizontales alternadas en el plano confocal del microscopio, creando así pinholes virtuales.

¿Por qué debe girar el disco?

Si el disco no girara, produciría una imagen estática y brillante. Además, el giro asegura que se produzca el barrido necesario para generar una imagen confocal completa.

Microscopía de Dos Fotones

Es un proceso poco conocido en la naturaleza, salvo en las estrellas. Presenta un reducido fotodaño y permite alcanzar distancias mucho mayores (entre 600 y 800 micrones) dentro de la muestra. Utiliza microscopios de fluorescencia.

Si se reduce la excitación, no hay iluminación ni arriba ni abajo del plano focal. No es confocal porque no necesita pinhole. Las longitudes de onda más grandes utilizadas en esta técnica penetran mucho más en los tejidos.

Ventajas de la Microscopía de Dos Fotones:

• Excelente recolección de fotones.
• No requiere pinholes.
• El fotodaño se limita solo a la zona de enfoque.
• La resolución espacial es menor a mayor longitud de onda (lo que implica una menor resolución en comparación con la microscopía confocal tradicional, pero mayor penetración).