Estructura y Función de los Ácidos Nucleicos: Técnicas de Estudio

Estructura de los Ácidos Nucleicos

Nucleótidos y Enlaces

Los nucleótidos se unen entre sí mediante enlaces fosfodiéster. Otros enlaces importantes son el N-glucosídico (pentosa + base) y el éster (nucleósido + fosfato).

Tipos de ADN

• Cromosoma bacteriano: Bicatenario y circular, sin membrana.
• Plásmido: Replicación independiente, resistentes a antibióticos.
• ADN mitocondrial: Bicatenario y circular, replicación independiente.
• ADN copia: A partir de ARN aislado mediante retrotranscriptasa.
• ADN viral: Bicatenario o monocatenario, lineal o circular.

Tipos de ARN

Generalmente monocatenario y lineal, excepto en algunos virus (bicatenario).

• ARN mensajero (ARNm): Porta información para la síntesis de una proteína. En procariotas es policistrónico (varias proteínas) y en eucariotas, monocistrónico.
• ARN ribosómico (ARNr): Síntesis de proteínas, el mayoritario en las células.
• ARN de transferencia (ARNt): Transportan aminoácidos hasta los ribosomas.
• ARN con función reguladora: Bloquean la traducción a proteína o activan enzimas que degradan ARNm.
• ARN heterogéneo nuclear (ARNhn): Dan lugar a ARNm después de la maduración.
• ARN pequeño nuclear (ARNpn): Dan lugar a ribonucleoproteínas, intervienen en la maduración del ARNm.
• ARN pequeño nucleolar (ARNpno): Precursor del ARNr.

Procesos Clave

Replicación

Proceso semiconservativo, bidireccional, secuencial y semidiscontinuo.

Enzimas implicadas:

• Helicasa: Desenrolla y separa las cadenas.
• SSBP: Evitan que se vuelva a formar la doble hélice.
• Girasa y Topoisomerasa: Relajan la tensión mediante cortes y empalmes.
• Polimerasa: Síntesis de la nueva cadena añadiendo al extremo 3', corrigen y reparan mediante actividad exonucleasa.
• Primasa: Sintetiza cebadores.
• Ligasa: Une fragmentos.

Transcripción

Síntesis de ARN a partir de ADN mediante polimerasas.

Los intrones (secciones que se transcriben pero no se traducen) se eliminan mediante:

1. Adición de caperuza en 5'.
2. Adición de cola de poli-A en 3'.
3. Eliminación de intrones mediante empalme (espliceosoma).

Traducción

Síntesis de proteína a partir de ARNm en los ribosomas.

1. Unión de la subunidad menor del ribosoma al ARNm en el codón AUG.
2. ARNt con metionina se sitúa en el sitio P.
3. Translocación.
4. Codón de terminación.

Nucleasas y Manipulación de Ácidos Nucleicos

Nucleasas

Cortan y degradan ácidos nucleicos mediante hidrólisis de enlaces fosfodiéster.

• Endonucleasas: Bacterianas, reconocen secuencias cortas de ADN bicatenario y producen un corte.
  • Extremo romo: Mismo punto.
  • Extremo cohesivo: Distinto punto, gran reactividad.
  Aplicaciones: Síntesis de moléculas de ADN recombinante y patrones de restricción.
• Desoxirribonucleotido transferasa terminal: Cataliza la incorporación de desoxinucleótidos al extremo 3' en el ADN.

Extracción de ADN

Obtención de un lisado homogéneo en el que los ácidos nucleicos están libres de membranas.

• Detergentes.
• EDTA: Atrapa magnesio e inhibe ADNasas.
• Proteasas: Para tejidos frescos y FFPE.
• Agentes caotrópicos.

Purificación de ADN

• Solventes orgánicos: Distinta solubilidad de los compuestos.
• Salting out: Precipitación de proteínas en presencia de sal.
• Cromatografía de intercambio iónico: Unión electrostática reversible.
• Cromatografía de adsorción: Adsorción de ácidos nucleicos al vidrio y sílice.
• Esferas magnéticas: Unión de ácidos nucleicos a microesferas.
• Ultrafiltración: Retención por tamaño.
• Plásmidos: Lisis alcalina.

Control de Calidad del ADN

• Integridad: Tamaño original.
• Pureza: Ausencia de contaminantes.
• Cociente 260/280: Proteínas y derivados fenólicos. Menor a 1.6: contaminación. Mayor a 2: ARN elevado.
• Para ARN: Entre 1.8 y 2.1.
• Cociente 260/230: Carbohidratos y sales. Menor a 1.5: contaminado.

Desnaturalización y Renaturalización

• Desnaturalización: Curva de fusión del ADN: tipo sigmoide. Tm (temperatura de fusión): cuando la desnaturalización es del 50%. A mayor contenido GC, mayor Tm.
• Renaturalización: Valor Cot_1/2: renaturalización del 50%. A mayor complejidad, mayor Cot.

Sondas y Técnicas de Hibridación

Tipos de Sondas

• ADN:
• Síntesis química: Monocatenarias, tamaño reducido.

Recombinante: Bicatenarias, gran tamaño.PCR: Bicatenarias, tamaño intermedio.ARN:Síntesis química.Transcripción: Transcribir vector con fragmento de interés.Ácidos nucleicos peptídicos (PNA): Sin carga eléctrica, no degradadas por nucleasas, muy específicas.

Marcaje de Sondas

• Isótopos radiactivos: Gran sensibilidad.
• Fluorocromos: FISH, microscopio de fluorescencia.
• Haptenos: No alteran la especificidad de la sonda.

Hibridación en Soporte Sólido

• Dot Blot: Membrana de nitrocelulosa o nailon. Tipos:
  • ASO Dot Blot: Detección de variantes alélicas.
  • Inverso: Distingue homo y heterocigotos.
  • Hibridación de colonias: Detecta bacterias.
  • Hibridación de placas virales: Detecta virus.
• Southern Blot: Detecta fragmentos de ADN. Permite la detección simultánea de varias secuencias.
• Northern Blot: Detecta fragmentos de ARN. Análisis de expresión génica.
• Microarrays: Miles de secuencias distintas. Estudios de expresión génica, detección de microorganismos.

Hibridación en Fase Líquida

• Captura de híbrido: Anticuerpos específicos reconocen los híbridos formados.
• ADN ramificado: Amplificación de señal.

Hibridación In Situ

Sobre tejidos. Tipos de muestras: cromosomas en metafase, núcleos interfásicos, extensiones citológicas y secciones de tejido.

• FISH (Hibridación in situ con fluorescencia): Sondas marcadas con fluorocromos. Detecta alteraciones cromosómicas.
  • Interfásica: Anomalías numéricas y estructurales.
  • Metafásica: Identifica cromosomas específicos.
• CISH (Hibridación in situ cromogénica): Reacción inmunohistoquímica. Se realiza en tejido FFPE. Detección de virus oncológicos, estudios de expresión génica.