Estrategias de Expresión Génica en E. coli: Replicón y Promotores Inducibles Clave

El Replicón: Control del Número de Copias del Vector

El Replicón controla el número de copias del vector recombinante dentro del hospedero. El origen de replicación está asociado a elementos regulados en cis.

Impacto del Incremento del Número de Copias

Un incremento en el número de copias podría acarrear varias consecuencias negativas:

• Carga metabólica excesiva.
• Descenso en la tasa de crecimiento bacteriano.
• Inestabilidad plasmídica.
• Baja en la síntesis proteica.

¿Es esto siempre cierto? No necesariamente. Al aumentar el origen de replicación (ORI), se puede incrementar el rendimiento en la síntesis proteica.

El Promotor: Regulación del Inicio de la Transcripción

El promotor es el elemento que regula el inicio de la transcripción. A continuación, se describen los principales sistemas inducibles utilizados en E. coli:

1. Promotor Lac
2. Promotor Tac
3. Promotor λpL / λpR (Termoinducción)
4. Sistema de Expresión T7

1. Promotor Lac

El Promotor Lac es un sistema inducible. Su regulación depende de la presencia de glucosa y lactosa:

• Presencia de Glucosa: El metabolismo favorece la vía de la glucosa y reprime la vía de la lactosa (expresión de lacI, produciendo el represor que bloquea el Operador lac).
• Presencia de Lactosa (Inductor): La lactosa se une al represor, cambiando su conformación e inhibiendo su unión al operador. Además, el complejo AMPc-CAP (Catabolite Activator Protein) se une al promotor y maximiza la transcripción.

Al fusionar el operón lactosa al gen de interés, se induce la expresión del gen (hasta 5000 copias por célula usando IPTG).

Desventajas del Sistema Lac

Este sistema inducible es poco utilizado debido a:

• Es un promotor bastante débil (no conduce a altos niveles de expresión).
• En ausencia de inducción (IPTG o lactosa), se expresan niveles significativos de los genes lac (expresión basal).
• Pueden producirse mutantes del inductor (ej. lacIq), lo que resulta en la sobreproducción del represor.

2. Promotor Tac

El Promotor Tac posee secuencias híbridas que combinan las regiones reguladoras -35 y -10, formando una secuencia consenso entre los promotores lac y trp (sitio operón para la unión de la RNA polimerasa).

• Es inducible por IPTG y es aproximadamente 5 veces más fuerte que el promotor lac.
• Sigue siendo reprimido por lacI; un aumento en la concentración del represor resulta en una fuerte represión del promotor Tac.

Regulación y Alternativas

La expresión Tac es proporcional a la presencia de IPTG: una disminución en la concentración de IPTG resulta en una disminución de la expresión.

Una alternativa al operón Tac es el uso del Operón Arabinosa (pBAD o pARA). En este sistema, la expresión está regulada por el activador AraC en presencia de arabinosa en el medio. Sin embargo, la expresión se observa disminuida en presencia de glucosa (debido a la represión catabólica).

3. Promotor λpL / λpR: Sistemas de Termoinducción

Este promotor es inducible por calor mediante el uso de la cepa mutante cI (específicamente cI857). La proteína represora cI es sensible al calor (termolábil), lo que significa que no se une al ADN a altas temperaturas, permitiendo la transcripción.

Regulación Dual

El gen cI puede ser controlado por el operón trp. La adición de triptófano al medio previene la expresión del represor vía Trp, lo que incrementa la actividad del promotor λpL/λpR.

Desventajas de la Termoinducción

El sistema de termoinducción presenta serios inconvenientes:

• Bajas tasas de crecimiento celular.
• Potencial daño al hospedero.
• Disminución de la viabilidad y productividad de proteínas heterólogas.
• Riesgo de misfolding (plegamiento incorrecto) e inestabilidad del plásmido.

4. Sistema de Expresión T7 (Vector pET)

Este es uno de los sistemas más potentes para la producción de proteínas recombinantes.

1. El gen de interés se clona en un vector (ej. pET) bajo el control del Promotor T7.
2. La RNA polimerasa T7 se une específicamente a la secuencia promotora T7 del vector.

Mecanismo de Inducción

Dado que E. coli silvestre no posee la RNA polimerasa T7 (y por lo tanto, no hay transcripción), el vector pET debe transformar una cepa especializada, como BL21-DE3. Esta cepa posee el gen T7 (gen 1) bajo el control del promotor lac.

El IPTG induce la expresión de la RNA polimerasa T7 en BL21-DE3 mediante el secuestro del represor lacI.

Control de la Expresión Basal (pLysS)

Incluso sin inducción por IPTG, el operón lac puede expresar el gen T7 (RNA polimerasa) de manera defectuosa (expresión basal).

Para mitigar esta expresión basal, E. coli debe ser co-transformada con un plásmido accesorio, como pLysS. Este plásmido produce la lisozima T7, una enzima que inactiva la RNA polimerasa T7 cuando no hay inductor presente, asegurando un control estricto de la expresión.