Espectroscopia Molecular de Absorción Vis-UV: Una Guía para la Identificación y Análisis de Compuestos Orgánicos

Espectrometría molecular de absorción vis-UV

1. Energía molecular electrónica

El intercambio de la energía electrónica de átomos y moléculas con radiación electromagnética da lugar a técnicas de absorción y de emisión principalmente en las regiones visible y ultravioleta, pero que, en general, pueden abarcar desde el infrarrojo próximo hasta los rayos X. Los espectros electrónicos resultan mucho más complejos que los espectros de vibración, siendo, generalmente, muy difícil obtener la estructura de las bandas. No obstante, dada la mayor capacidad instrumental de que se dispone en esta región del espectro, su medida es enormemente útil, y encuentran importantes aplicaciones en análisis cuantitativo. El estudio de este tipo de técnicas espectroscópicas se comenzará con la consideración de la energía de los electrones en las moléculas.

2. Se sabe que numerosas propiedades moleculares como

, por ejemplo,frecuencia de vibracion, energia de disociacion, distancia internuclear, etc., resultan dependientes casi de modo exclusivo de cada par de nucleos en una molecula, sin que el resto de la molecula sea relevante en este aspecto. Esta observacion es la que condujo, hace ya tiempo, al concepto quimico de enlace. Pues bien, de la misma forma que, en un primer analisis, las propiedades y estructura electronica moleculares pueden describirse en terminos de las energias de sus enlaces, la capacidad de absorcion de radiacion por parte de las moleculas en la region visible-ultravioleta, puede abordarse a partir de las propiedades de los enlaces aislados. En el desarrollo que sigue, limitaremos nuestras consideraciones al caso de moleculas organicas, es decir, moleculas casi exclusivamente constituidas por C, H, O, N, S, P, y algunos otros pocos atomos.

4.1.3. Para poder predecir los estados de energia electronica moleculares deberia resolverse la correspondiente ecuacion de Schrodinger: Hel Øel Eel Øel , para todos los electrones de la molecula, embebidos en el campo de energia potencial impuesto por los nucleos. Aunque se considere, de acuerdo con la aproximacion de Born-Oppenheimer, que los nucleos permanecen estaticos en comparacion con el movimiento electronico, este tipo de calculo es demasiado complicado para moleculas de pocos electrones e impracticable en cuanto el numero de nucleos es un tanto importante. Existen, sin embargo, una serie de afortunadas aproximaciones que han permitido llevar cabo generalizaciones de mucha utilidad. Por ejemplo, la mayor parte de los electrones de una molecula se encuentran muy localizados alrededor de los nucleos, pudiendose describir su comportamiento, de forma muy apropiada, mediante los mismos orbitales atomicos de los atomos aislados. Los otros pocos electrones, mas deslocalizados, permiten ser descritos por orbitales que engloban, al menos, dos nucleos, denominandose orbitales moleculares. Son estos electrones los que participan en los enlaces quimicos y con los que se puede interpretar cualitativamente el comportamiento espectral de la molecula en la region vis-uv.

4.1.4. En la mayor parte de las moleculas organicas, puede considerarse que hay electrones de cuatro tipos: 1) electrones atomicos en capas cerradas, que no participan en los enlaces y que, al poseer elevadas energias de excitacion, no contribuyen a la absorcion de radiacion visible-ultravioleta 2) Electrones que participan en enlaces covalentes sencillos, como en C-C, C-H, O-H, etc., cuya descripcio?n se puede hacer mediante funciones que admiten el eje internuclear como eje de revolucion, denominados orbitales ó. Su energia de excitacion es relativamente elevada, por lo que los transitos en los que participan estos electrones ó, tienen lugar en el ultravioleta lejano. 3) Electrones no enlazantes, en forma de pares electro?nicos en orbitales atomicos de capas incompletas, como por ejemplo, en el O, S, N, los halo?genos, etc. A este tipo de electrones se les designa como electrones n y producen absorcio?n de radiacion en la region ultravioleta. 4) Electrones que participan en dobles y en triples enlaces, como en C=C, C-C, C=N, etc., cuya descripcion ha de realizarse mediante funciones antisimetricas respecto de un plano, conocidas como orbitales ð. La excitacio?n de estos electrones ð es la responsabe de la mayor parte de la absorcion de radiacion por parte de la molecula en las regiones visible y ultravioleta.
4.1.5. Transitos entre estados electronicos. Ademas de los orbitales ocupados, una molecula posee orbitales desocupados o anti-enlazantes. Los estados excitados moleculares pueden describirse haciendo uso de estos orbitales del estado fundamental desocupados, distinguiendoseles de los anteriores asigna?ndoles un asterisco (*). Se habla, entonces de orbitales sigma-estrella o pi-estrella (ó* o? ð*). La absorcion de luz puede asi explicarse, considerando que la molecula cambia el estado energetico de un electron desde un orbital enlazante o no-enlazante a otro anti-enlazante. No obstante, no todos estos transitos (transformaciones) son igualmente probables. Mediante ciertas consideraciones de simetria, puede demostrarse que las transiciones permitidas son aquellas en las que los orbitales involucrados son del mismo tipo (figura 1). Segun el caso, se las designa como transiciones ó ? ó* o? ð ? ð*. Con menor probabilidad (menor intensidad de absorcio?n) pueden tambien observarse transitos n ? ó* y n ? ð*. Debido a que la interpretacio? teorica de estas ultimas resulta complicada, es por lo que se a veces se las menciona como transiciones prohibidas.

4.1.6. La disposicio?n relativa de la energia de estos estados es en este orden, menor a mayor energia: ó, ð, n (cuyo estado corresponde a la energia de los electrones en orbitales atomicos y, por lo tanto, puede tomarse como cero de energias moleculares), ð* y ó*. Las transiciones ó

ó* y n ? ó* son, generalmente, las que conllevan mayor cambio en la energia; tienen lugar con radiacio?n correspondiente al ultravioleta lejano (ë inferior a los 200 nm). Debido a que todas las moleculas poseen enlaces sencillos (con orbitales ó),

4.1.6 bis:  todas las moleculas presentan algunas transiciones de este tipo, incluso el nitrogeno y el oxigeno del aire, por lo que para llevar a cabo el analisis de esta clase de absorcion, hay que trabajar en vacio extremo. La region del ultravioleta lejano se denomina tambien, por este motivo, ultravioleta de vacio. La experimentacion en este caso requiere condiciones muy estrictas, y no suele utilizarse en determinaciones de rutina. Los transitos ð ? ð* y n ? ð* involucran menor cantidad de energia y suelen ocurrir con radiacion del ultravioleta proximo y del visible.

4.1.7. La amplia experiencia acumulada acerca de la capacidad de absorcion de moleculas organicas en la region ultravioleta-visible, pone de manifiesto que algunos tipos de moleculas y grupos funcionales presentan un comportamiento propio, tanto en la localizacion de las bandas de absorcion como en la intensidad de la absorcion. Estos hechos pueden utilizarse con fines analiticos para identificar determinadas caracteristicas estructurales presentes en una determinada especie quimica. En este contexto, se ha desarrollado cierta terminologia especializada para describir estos comportamientos. Asi, por ejemplo, se denomina cromoforo a cualquier grupo funcional responsable de absorcion de radiacion por parte de la molecula a la que pertenece. Lo mas general es que los cromoforos sean grupos con uno o varios enlaces multiples (dobles o triples). El grupo carbonilo o el anillo bencenico, son ejemplos de cromoforos.

4.1.8. Un auxocromo es aquel otro grupo que, sin presentar de por si capacidad de absorbente, su presencia en la molecula hace incrementar la absorcion de radiacion por parte de los grupos cromoforos. Generalmente, los auxocromos son grupos que contienen pares electronicos no compartidos, los cuales interaccionan con la carga electronica de los grupos cromoforos cercanos. Ejemplos de auxocromos son los grupos -OH, -NH2 , etc. En ocasiones, una modificacion en las propiedades del medio o bien un pequen?o cambio en la estructura molecular producen un desplazamiento de la longitud de onda del maximo de absorcion de una banda hacia valores mas altos (menor energia en el transito); este fenomeno se conoce como efecto batocromico, o desplazamiento al rojo. El comportamiento contrario se conoce como efecto hipsocromico o desplazamiento al azul. Cuando un cambio en el disolvente o una pequena modificacion estructural hacen que se incremente la capacidad de absorcion de una sustancia (aumento de å), el fenomeno recibe el nombre de efecto hipercromico. En el caso contrario se habla de efecto hipocromico.

4.3.Cromoforos alifaticos
4.3.1. Hay algunas generalizaciones acerca del comportamiento absorbente de las moleculas organicas que es importante resaltar. Considerese, en primer lugar, la existencia de enlaces multiples aislados dentro de una molecula. El factor mas importante que determina la localizacion del maximo de absorcion es la naturaleza de la pareja de atomos que forman el enlace (doble o triple). Como puede apreciarse en la Tabla de Cromoforos alifaticos que se presenta al final de esta pagina, este efecto es mucho mas importante en las transiciones n ? ð* que en las ð ? ð*, lo cual pone de manifiesto la accion directa que el atomo ejerce sobre los electrones n, que no toman parte en el enlace. Otros cambios mas relevantes se observan cuando dos o mas enlaces dobles se encuentran conjugados en la mole?cula, por ejemplo: -C=C-C=C-, o? -C=C-C=O. Los tra?nsitos ð ? ð* incrementan, en general, tanto la longitud de onda del maximo de absorcio?n como la capacidad absorbente, al aumentar el nu?mero de dobles enlaces conjugados. La acumulacion de dobles enlaces conjugados en una mole?cula hace que la diferencia de energia que separa el orbital ð enlazante mas energetico (HOMO) del orbital ð* antienlazante menos energetico (LUMO), disminuya al aumentar el numero de orbitales ð conjugados. Como ejemplo ilustrativo, en la figura se presenta el espectro de â-caroteno.

4.3.2. Asimismo, a modo de ilustracion adicional, en el Diagrama 1 se dan los espectros de absorcion uv de varios farmacos conteniendo 2, 3, y mas dobles enlaces conjugados en su estructura molecular. Puede observarse el efecto batocromico que el incremento del numero de dobles enlaces en la molecula produce en las correspondientes bandas de absorcion.

4.3.3. Cromoforos aromaticos. Los compuestos aromaticos presentan particularidades espectroscopicas propias y diferentes de las sustancias alifaticas. Estas particularidades pueden atribuirse a la alta simetria del grupo bencenico. El espectro del benceno, que es el representante de la serie, se caracteriza por tres bandas de absorcion: una primera banda, muy intensa, centrada alrededor de los 170 nm y, por lo tanto, de poca utilidad analitica; una segunda banda, de bastante intensidad de absorcion, pero inferior a la anterior, con la que solapa tomando el aspecto de un hombro, centrada alrededor de los 200 nm; y una tercera banda mas debil, que facilmente presenta la estructura fina de los niveles de vibracion de la especie excitada, centrada aproximadamente en los 254 nm (figura 2). Estas bandas, afectadas de efecto batocromico de mayor o menor importancia, resultan caracteristicas de casi todos los compuestos con grupos aromaticos (vease, por ejemplo, los espectros de fenol y de azobenceno, en la figura 3)

4.3.4. La presencia de sustituyentes en el anillo bencenico desplaza este espectro y generalmente suaviza la estructura fina de vibracion. Este comportamiento puede observarse tambien, en el caso de los hidrocarburos aromaticos policiclicos (naftaleno, antraceno, fenantreno, pireno, etc.), si bien las bandas de absorcion se van desplazando cada vez mas hacia longitudes de onda mas largas, a medida que aumenta el numero de electrones ð de la molecula. En ultimo termino, la absorcio?n de grafito, que es una forma alotropica del carbono, con estructura laminar constituida por una red de anillos bence?nicos fundidos (naturalmente, sin los hidrogenos), abarca ya toda la radiacion visible, por lo que la sustancia cobra su caracteristico color negro brillante. Algunas de estas particularidades se exponen en la Tabla de Cromoforos aromaticos.
4.3.5. El comportamiento espectrosco?pico de las sustancias con actividad farmacologica puede deducirse a partir de los discutido anteriormente. En los Diagramas 1 y 2 se presentan, a modo de ejemplos ilustrativos, algunos de estos comportamientos para diferentes fa?rmacos en cuya estructura contienen algunos de los tipos de cromoforos considerados anteriormente.
4.3.6. Influencia del disolvente. El espectro de absorcion de una sustancia en estado gaseoso puede considerarse el espectro genuino de las moleculas aisladas, ya que, debido a las grandes distancias que las separan, la interaccion que ejercen entre ellas suele ser muy pequena. En estas condiciones es posible registrar detalles muy finos de los transitos electronicos e incluso la estructura de los transitos a diferentes estados de vibracion dentro del estado electronico excitado. Cuando la sustancia se encuentra, sin embargo, disuelta en un medio liquido, las interacciones soluto-disolvente impiden la libertad de movimientos rotacionales y limitan notablemente los vibracionales, de modo que el resultado es una perdida de detalles en la estructura fina del espectro de absorcion molecular. Este efecto suele ser mas importante cuanto mas polar es el disolvente. Los disolventes a base de hidrocarburos suelen mostrar mas detalles espectroscopicos de las mole?culas que los mas polares, tal como alcoholes y el agua.

4.3.7. El efecto del disolvente sobre los espectros de absorcion permite, ademas, distinguir entre transitos electronicos del tipo n ? ð* o? ð ? ð*.Los electrones tipo n interaccionan fuertemente con los disolventes polares,los cuales los estabilizan, rebajando su estado energetico. El resultado es un incremento en la diferencia de energia que existe entre el estado n y el estado excitado ð* con el consiguiente desplazamiento de la longitud de onda del transito hacia valores mas pequenos (frecuencias mayores), lo que se denomina efecto hipsocro?mico. Para los transitos ð ? ð*, normalmente ocurre lo contrario, el disolvente estabiliza mas al estado excitado, ð*, que al estado fundamental, de forma que la diferencia

4.3.7 bis  : de energia entre ambos se reduce y la longitud de onda del transito se desplaza a valores mayores (frecuencias inferiores). El efecto es del tipo batocromico.  4.3.8. El cambio del pH del medio puede afectar de forma muy sustancial al espectro de sustancias con propiedades acido-base. El ejemplo de un indicador acido-base, cuya disolucion cambia de color cuando se modifica la acidez o alcalinidad del medio, ilustra de modo simple este comportamiento. La ionizacion de las moleculas organicas puede destruir o reforzar la conjugacion de los dobles enlaces, provocando notables cambios en laforma del espectro de absorcion, con desplazamientos en la localizacion de los maximos de absorcion que pueden ser hasta de varias decenas de nm. El estudio de este comportamiento en funcion del pH proporciona un metodo especifico para la determinacion de constantes de disociacion acido-base (pKa ). Numerosos compuestos con actividad farmacologica se ven afectados por este efecto.
4.3.10. La region del espectro en el que se pueden observar los transitos electronicos moleculares de los que se ha tratado con anterioridad, abarca parte del infrarrojo proximo (NIR, mas o menos la zona entre 1000 y 750 nm), la region visible (vis, de 750 a 400 nm) y la region del ultravioleta proximo (uv, entre 400 y 200 nm). Mas alla de 200 nm el aire comienza absorber la radiacion de forma notable y el trabajo experimental resulta mas complicado.
4.3.11. La fuentes de radiacion para la region visible son generalmente lamparas incandescentes, cuyo espetro de emision abarca tambien parte del IR. En la region ultravioleta se utilizan lamparas de descarga de deuterio.

4.3.12. Los espectrofotometros vis-uv son generalmente de doble haz. La radiacion monocromatica se bifurca en dos haces que se les hace pasar, uno por la cubeta conteniendo la muestra y el otro por la cubeta que contiene el disolvente, que se conoce como cubeta de referencia, cuya intensidad transmitida se toma como I0 . En la practica se utiliza un unico haz de luz que, mediante un sistema de espejos, se le hace incidir alternativamente, en intervalos muy breves de tiempo, sobre cada una de las cubetas.

4.3.13. El monocromador suele ser un prisma dispersor o una rejilla de difraccion. Tanto el material del que esta construido el monocromador como las ventanas de las cubetas ha de ser lo mas transparente a la radiacion. En la region visible, el vidrio es un excelente transmisor, pero no lo es suficientemente para la radiacion ultravioleta. En longitudes de onda inferiores a los 400 nm se suele utilizar cuarzo

4.3.14. La deteccion de la radiacion visible y ultravioleta se lleva a cabo de forma muy precisa mediante el uso de celulas fotovoltaicas o dispositivos fotoconductores. La elevada precision en la medida de la absorbancia que se consigue en este tipo de espectrofotometrias encuentra numerosas aplicaciones en la determinacion cuantitativa de sustancias en disolucion.

4.4. Radiacion UV y piel
4.4.1. A la hora de considerar los efectos biologicos, la region ultravioleta se subdivide en tres subregiones: uvA, para ë entre 400 nm a 320 nm, uvB, con ë de 320 nm a 290 nm , y uvC, de ë
4.4.2. El efecto nocivo de la radiacion solar sobre los organismos vivos puede acotarse si se dispone de una cuantificacion del dan?o producido e funcion de la longitud de onda. Esta funcio?n, conocida como espectro de accion, aunque diferente para cada organismo, es basicamente similar para todos ellos. En el diagrama de la izquierda de la figura 4 se representa la capacidad erite?mica, es decir, de produccion de enrojecimiento y quemaduras sobre la piel de la radiacion solar, a diferentes longitudes de onda. Como se puede observar, el efecto nocivo depende de la longitud de onda, y esta? muy limitado por debajo de 290 nm, por la escasa capacidad de transmision de la atmosfera a la radiacion uv. La accio?n de los filtros solares se disena de forma que contengan sustancias absorbentes con un espectro de absorcion que se acomode lo ma?s posible a este espectro de accion relativo. Algunas de estas sustancias son derivados del acido benzoico, benzofenona, acido cina?mico, etc., cuyo espectro se presenta a la derecha de lafigura 4, con fines comparativos.
4.5.LUMINISCeNCIA 4.5.1 Desexcitacionmolecular. Luminiscencia. Elfenomenodeabsorciondeluzporpartedelasmoleculas, discutidoenelcaptuloanterior, parece, enlapractica, quenodependedeltiempo. Esdecir, cuandoseregistraelespectrodeabsorciondeunamuestrademanerarepetidaenun intervalocortodetiempo, engeneralnoseobservancambiossignificativosenlamedidadelaabsorbancia. Estehechoindicaqueelnumerode moleculasconcapacidadabsorbente -lasmole?culasquepueblanelestado fundamental- permanecesensiblementeuniforme, locualso?loencuentra interpretacio?nsiseadmiteque, despuesdesuexcitacion, lasmoleculas regresanmuyrapidamentedelestadoexcitadoalestadofundamental. Puedenexistirdiversosmecanismosmediantelosquelasmoleculaspuedenperderlaenergiadeexcitacio?n. Entodoselloshaycesio?ndeenergiaal sistemaenformadeenergiatermica, procesoconocidocomodesexcitacion noradiativa; so?loenalgunoscasosotrapartedelaenergia, previamente absorbida, esliberadaenformaderadiacio?nluminosa. Aestosprocesosse lesconocegenericamentecomoluminiscencia.

4.5.2. Laluzemitidaenformadeluminiscenciapuedeserultravioleta, visibleoinfrarroja, yesemitidapormoleculasenestadoelectro?nicoexcitado. Lapalabraluminiscenciaserefiereengeneralalaemisiondeluzpor lassustanciasdespuesdesufrirunprocesodeexcitacionquenoincluye elaumentodetemperatura. Enestesentidosediferenciadelfenomenodeincandescencia, oemisiondeluzcaliente. Laluminiscencia, oemisio?nde luzfr??a, puedeclasificarse, segunelmododeexcitacio?nenFotoluminsicencia, Quimioluminiscencia, Bioluminiscencia, Electroluminiscencia, Sonoluminiscencia, Radioluminiscencia, etc. Desdeelpuntodevistadela determinacioncuantitativadesustancias, nosinteresanprincipalmentelos feno?menosdeFotoluminiscencia, enlosqueelmododeexcitacioneslaabsorcio?ndefotones, queasuvezpuedepresentarsededosformasdiferentes, fluorescenciayfosforescencia.

4.5.3. Desexcitacionnoradiativa. Cuandounamole?culaabsorbela energiadeunfoto?nyespromovidaaunestadoelectronicodeenergia superior, S0 ? S1 , elprocesoocurreenunaescaladetiempos (? 10?18s) muchoma?scortaquelademovimientodelosnucleos (? 10?12s), porlo quepuedeconsiderarsequeelestadoexcitado, S1 , conservalageometr??a moleculardelestadofundamental, S0 , enelmomentodelaabsorcion. En lamayorpartedeloscasos, estaconfiguracionnocorrespondealestado demenorenergiavibracionaldelestadoexcitado, porloque, alexceso deenergiaelectronicaacumuladoenesteestadoexcitado, sesumacierto excesodeenerg??adevibracion. Esteexcesodeenergiavibracionalsedisipa deformaespontaneaenformadecolisionesconlasmoleculascircundantes; atemperaturaordinariaelprocesopuededurar ? 10?8s, esdecir, unas miladiezmilvibracionesmoleculares. 4.5.4. Duranteelcursodeladesexcitacionvibratoriadelestadoexcitado, S1 , puedeocurrirquelamole?culaadopteunaconfiguracionnuclearquecorrespondatambienaotroestadoelectronico. Lamole?culapuedeentonces cambiardeestadoelectronicoypasaralestadoS0 ; sedicequehatenido lugarunaconversioninterna, IC. Estasinterseccionespuedensermuyfrecuentesenelcasodemoleculaspoliatomicas, queposeenungrannumero degradosdelibertaddevibracion. Segunesto, noesdificilimaginarque, medianteunaseriedeconversionesinternas, unamoleculapuedaregresar alestadofundamentalsinemitirradiacion. Estefenomeno, impulsadoprincipalmenteporlascolisionesentremoleculas, resultamuyra?pidoenfase liquida, inclusoatemperaturaambiente.

4.5.5. Fluorescencia. Siladesexcitacio?nnoradiativatienemuypocaprobabilidaddeproducirse, elregresoalestadofundamentaldeuna moleculadesdeelestadoexcitadopuederealizarseperdiendopartedela energiaenformaderadiacion. Estefenomenoseconoceconelnombrede Fluorescencia, sieltra?nsitotienelugarentreestadosdelamismamultiplicidad (transitopermitido). Aunqueeltiempodevidamediadelestado excitadoespequen?o, delordende10?6 - 10?9s, es, sinembargo, muy grandeencomparacionconeltiempoquetardalamole?culaenperdersu energiadevibracion, porloquelaemisionderadiacionseproducedesde elestadodevibracio?nma?sbajo. Comoenelcasodelaabsorcion, latransiciondesdeelestadoexcitadoalestadofundamentalesmuyrapidaypuede queconduzcaalamoleculaaunestadodevibracionexcitado, enelestado electronicofundamental. Esteexcedentedeenergiadevibracionsedisipa tambienatravesdecolisiones. Elresultadoesquelaenergiaqueseemite enformadeluzessiempremenorquelaenergiaabsorbida, esdecir, la frecuenciadelaluzemitidaenprocesosdefluorescenciaessiempremenor (longituddeondamayor) queladelaradiacio?nabsorbida.

4.5.6. Fosforescencia. Sielestadoexcitadocruzasucurvadeenergia potencialconotroestadodedistintamultiplicidad (triplete), T1 , existeuna pequen?aprobabilidaddequelamole?cularealiceunaconversioninternaa esteestadoelectronicodediferentemultiplicidad. Sedice, enestoscasos, quesehaproducidouncruceintersistemas, ISC. Elprocesodedesexcitacionradiativaentreestadosdedistintamultiplicidad, T1 ? S0 , sise produce, seconocecomoFosforescencia. Esdiferentealafluorescenciapor elhechodequelaemisio?ndeluz, muyimpedidaenprincipio, seproducealcabodeunintervalodetiempomuchomayor, despuesdeproducida laexcitacio?n; esdecir, elestadoexcitado, T1 , tieneuntiempodevida mediamuysuperioraS1 . Atemperaturaambienteyendisolucion, predominanlosprocesosdedesexcitacionnoradiativadesdeelestadotriplete. Enefecto, comoelprocesoradiativoesta?tanretrasado, duranteestelargo intervalodetiempo, lasnumerosascolisionesentrelasmole?culasfavorecen laapariciondenuevoscrucesintersistemaquehacequeladesexcitacionse realicedemodopreferenteatravesdeotrosmecanismos, fluorescentesono radiativos. Porelcontrario, amuybajastemperaturasoenunmediode mayorrigidez (porejemplo, solido), esmasfacilqueseproduzcanfenomenosdefosforescencia. Enestascondiciones, eltiempoderetardoentrela excitacio?nylaemision, puedeserdevariossegundos, minutosoincluso mayor. Evidentemente, debidoaqueelestadotriplete, T1 , tienemenor energiaqueelcorrespondienteestadosingulete, S1 , (regladeHund), laluz emitidaenformadefosforescenciatienefrecuenciaaunmenor (longitudde ondasuperior) quelacorrespondienteradiacionfluorescenteemitidaporel mismotipodemolecula.

4.6. Espectrofluorimetra
4.6.1. Espectro de Emision. Los espectros de excitacion y de emision de fluorescencia se registran con un instrumento denominado espectrofluormetro. La lampara debe emitir un flujo muy uniforme de fotones, en todo el margen de longitudes de onda que se desee explorar. En la practica, el espectro de emision de una sustancia, es decir, la medida de la intensidad de fluorescencia en estado estacionario, IF , a distintas longitudes de onda, ëF , se lleva a cabo con excitacion previa de la muestra utilizando una radiacion, de intensidad incidente, I0 , a una longitud de onda, ëE , en la que el fluoroforo presente suficiente absorcion, IA . El resto de la radiacion se considera radiacion transmitida, IT : IA = I0 ? IT
La intensidad de fluorescencia, IF (ëF , ëE ), sera? proporcional a la intensidad absorbida, IA (ëE ): IF = K0 · IA donde el para?metro K0 depende de diversos factores, entre los que destacan las particularidades o?pticas del instrumento. Por otra parte, la intensidad transmitida puede relacionarse con la intensidad incidente a trave?s de la ley de Lambert-Beer: IT = I0 · 10?(å`C) = I0 · e? ln 10(å`C) donde å, es la absortividad molar del fluoro?foro, `, es el paso o?ptico de la cubeta, y C, es la concentracion. El producto å`C representa la absorbancia a la longitud de onda de excitacion. Segun las ecuaciones 4.9-4.11, se obtiene:
IF = K0 · I0 · [1 ? e? ln 10(å`C) ]
4.6.2. Generalmente el factor K0 es desconocido, por lo que el valor de IF se mide en valores relativos y se expresa en unidades arbitrarias. En el caso de que la absorbancia sea pequen?a (a pequen?as concentraciones, por ejemplo), el factor exponencial puede aproximarse al primer te?rmino de su desarrollo en serie, 1 ? e? ln 10(å`C) ' ln 10(å`C), con lo que la ecuacio?n 4.12 se reduce a: IF ' K0 · I0 · ln 10(å`C) = K1 · C relacio?n que muestra que, a muy bajas concentraciones, la fluorescencia de una disolucio?n es proporcional a la concentracion. A concentraciones ma?s elevadas se observan desviaciones de la linealidad marcada por la ecuacio?n 4.13 e, incluso, el comportamiento no sigue estrictamente los establecido por la ecuacion mas general 4.12, debido, principalmente, a que parte de la radiacion emitida es reabsorbida por las propias moleulas de la muestra sin alcanzar el detector.
4.6.3. Espectro de excitacion. La variacion de la intensidad de fluorescencia en funcio?n de la longitud de onda de excitacion, ëE cuando la longitud de onda de observacion, ëF , se mantiene fija, representa el espectro de excitacio?n. Si se recurre a la ecuacion 4.13, se comprueba que estas variaciones son proporcionales al valor de la absorbancia, A = å`C, de modo que puede considerarse que el espectro de excitacion representa el espectro de absorcion. Con fines ilustrativos, en la figura 6 se dan los espectros de absorcion y emision de algunos compuestos con diferente rendimiento cuantico.

4.6.4. Fluoroforos. El comportamiento fluorescente de una mole?cula esta? inversamente relacionado con la flexibilidad de su estructura. Cuanto mas rigida sea la estructura molecular ma?s dif??cil sera? su desexcitacio?n por mecanismos no radiativos y mayor probabilidad existira de que lo haga mediante emisio?n de radiacio?n. La abundancia de sistemas electro?nicos ð (sistemas conjugados) incrementa la rigidez molecular y facilita el comportamiento luminiscente. Este hecho queda de manifiesto al comprobar que la mayor parte de los compuestos fluorescentes contienen grupos aroma?ticos. Por ejemplo, el naftaleno, antraceno, naftaceno y pentaceno, con dos, tres, cuatro y cinco anillos bencenicos fundidos, emiten fluorescencia ultravioleta, azul, verde y roja, respectivamente. Los transitos ð ? ð*, caracterizados por elevados valores de absortividad, dan tambie?n elevada intensidad de fluorescencia y notables valores de rendimiento cuantico. Cuando hay heteroatomos en la molecula de forma que los tra?nsitos del tipo n ? ð* son los de menor energia, la mole?cul presenta fluorescencia muy debil, con rendimiento cuantico pequen?o. Este caso ocurre en muchos azocompuestos y compuestos carbonilicos.

4.6.5. Existe una gran variedad de moleculas biologicas que contienen grupos fluoroforos. Citaremos so?lo algunos ejemplos: Proteinas: El aminoacido mas fluorescente es el tripto?fano, que proporciona cerca del 90 % de la fluorescencia de las proteinas. Su fluorescencia, ademas, es muy sensible al entorno molecular, por lo que las modificaciones que se observan pueden permitir caracterizar la polaridad del entorno, la union de ligandos, cambios conformacionales, etc. La tirosina, si bien es muy fluorescente cuando se encuentracomo compuesto libre en disolucio?n, su emisio?n se debilita notablemente cuando forma parte de una proteina. La desnaturalizacion generalmente se manifiesta con un incremento en la fluorescencia de los residuos de tirosina. Nucleo?tidos: Los nucleotidos y acidos nucleicos son, por lo general poco o nada fluorescentes. NADH: NADH es altamente fluorescente, con maximos de absorcion y emision a 340 y 450 nm, respectivamente, mientras que NAD+ no lo es. La fluorescencia es debida al anillo de nicotinamida. Cuando NADH se une a una proteina, su fluorescencia se ve incrementada, hasta cuatro veces. Riboflavina: La riboflavina y los nucleotidos FMN (flavinmononucleotido) y FAD (flavinadeninadinucleotido) tienen su ma?ximo de absorcion en 450 nm y emiten a 515 nm.
4.6.6. A menudo se utilizan compuestos extranos a un sistema, pero que poseen elevada fluorescencia, con objeto de que, al interaccionar con las mole?culas de la muestra, las modificaciones que se observen en su emisio?n nos permitan investigar caracteristicas estructurales que serian inabordables por otros procedimientos. Estas sustancias se denominan sondas fluorescentes.