Espectrometría de Masas: Características, Técnicas y Aplicaciones

Características de un TOF (Time of Flight)

1. Alto y constante Poder de Resolución (Rs ≥ 10⁴): Masa Exacta

2. Buena sensibilidad en SCAN (mucho mejor que el Q pero algo peor que el IT)

3. Amplio Intervalo de masas > 100.000 Da (teóricamente ilimitado)

4. Elevadas velocidades en la obtención de espectros (> 100 espectros/sg)

Ventajas de usar MS de Alta Resolución

• Mejora de la Selectividad: Separa iones con la misma Masa Nominal
• Mejora de la Sensibilidad: Elimina el ruido químico de igual masa nominal
• Determinación adecuada de la carga y la masa del Ion
• Limita el nº de posibles fórmulas moleculares: imprescindible para centrar la búsqueda de desconocidos

Efecto de la resolución en la medida de la masa

Cuando el equipo no puede resolver el perfil isotópico, las señales correspondientes a los diferentes isótopos se combinan para mostrar una única señal que se extiende a lo largo de diferentes m/z y cuyo valor máximo es la «masa media».

Tipos de MS y sus Aplicaciones

MS de masas pequeñas de forma nominal (rutina)

Fuentes de Iones: EI – CI – APcI – ESI – ICP

Analizadores: Q (cuantitativo) – IT (cualitativo/cuantitativo)

MS de masas pequeñas de forma exacta

Fuentes de Iones: EI – CI – APcI – ESI – GD

Analizadores: TOF – EB/EBE

MS de masas elevadas de forma nominal (rutina)

Fuentes de Iones: ESI

Analizadores: Q (cuantitativo) – IT (cualitativo/cuantitativo)

MS de masas elevadas de forma exacta

Fuentes de Iones: MALDI - ESI

Analizadores: TOF – EB/EBE

Tipos de detectores en MS

• Detector de conversión fotónica o de centelleo
• Detector multiplicador de electrones de dínodo continuo (para detección secuencial de iones)
• Detectores multicanales (para detección simultánea de iones)

Detector de Conversión Fotónica o de Centelleo

Consta de:

• Dinodo
• Pantalla fosforescente (de centelleo)
• Tubo fotomultiplicador

Características principales:

• Detección fuera del eje óptico
• Elevada sensibilidad
• Larga duración
• Elevada velocidad de respuesta
• Buena estabilidad

Hibridación Instrumental

Principios de la Hibridación Instrumental

En una hibridación o acoplamiento instrumental:

1. La primera técnica tiene como objetivo fundamental la separación total o parcial de los componentes de la muestra.
2. La segunda técnica tiene como objetivo fundamental la detección de componentes de la muestra, puros o en mezclas más sencillas que la muestra original.

Combinaciones posibles en los sistemas de hibridación instrumental:

1. Técnicas de MS entre sí: MS en tándem.
2. Técnicas de separación con MS: GC/MS, LC/MS, ...
3. Técnicas de separación con RMN: LC/RMN
4. Técnicas de separación entre sí: Cromatografía Multidimensional GCxGC, LCxLC, …

Requisitos de las técnicas en una hibridación instrumental

1. Compatibilidad: Los solutos que abandonan la primera técnica están en una fase móvil de cierta naturaleza química, a una presión, flujo y temperatura dados, cuyas características pueden impedir o no el funcionamiento de la segunda técnica, siendo posible un “acoplamiento directo” o necesario una “interfase de conexión”. Otra dificultad es el tiempo de respuesta de ambas técnicas.

2. Complementariedad: Combinar la información de ambas técnicas para conseguir resolver un problema que cada técnica por separado no podría.

3. Ortogonalidad: Las técnicas que se acoplan deben basarse en mecanismos tan diferentes como sea posible, lo que permitirá aprovechar al máximo la capacidad de las técnicas que se acoplan. No es un requisito imprescindible.

Espectrometría de Masas en Tándem (MS/MS)

Combinación de un mismo o diferente analizador con el objetivo de explotar las cualidades de cada uno de ellos evitando sus inconvenientes -> Experimentos MS/MS en el espacio -> mejora la sensibilidad, la selectividad y hace elucidación de estructuras complejas.

Los espectrómetros MS/MS constan de:

1. Una fuente blanda (API, CI o MALDI)
2. Un primer analizador (Q, …)
3. Una celda de colisiones (CID)
4. Un segundo analizador (Q, TOF, …)
5. Un detector

Cuadrupolo en tándem o triple cuadrupolo (QqQ)

Celda de Colisión con nitrógeno como gas de colisión: Los iones precursores chocan con el N₂ y convierten la energía de los impactos en Energía Vibracional hasta que se produce su fragmentación. El grado de fragmentación depende del voltaje aplicado como Energía de Colisión.

Modos de Trabajo de un QqQ

En equipos de MS/MS en el tiempo (IT) solo es posible el barrido de iones producto

• Barrido de iones producto
• Barrido de pérdidas neutras
• Barrido de iones precursores
• Monitorizar una reacción seleccionada (SRM)

Cuadrupolo + Tiempo de Vuelo (QTOF)

Modo de Trabajo de un QTOF: (MS²)

Modo Barrido de iones Producto -> elevada sensibilidad en SCAN ; elevada resolución

Técnicas de Separación acopladas a MS

Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas (GC/MS)

El Técnica de Separación separa los componentes de la mezcla para que lleguen al detector a distinto tiempo. El MS determinará la relación m/z de los compuestos separados, identificándolos en base a su espectro de masas y cuantificándolos en base al área de los picos del cromatograma.

Registro MS: monitorización de la corriente iónica total (SCAN)

• Cromatograma de Iones Totales (TIC): Representa en función del tiempo la intensidad de todos los iones detectados dentro del intervalo de masas seleccionado (espectro).
• Cromatograma del Pico Base (BPC): Representa la intensidad del ion del pico base, correspondiente al espectro obtenido en cada momento, en función del tiempo.
• Cromatograma de Iones Extraídos (EIC): Representa la intensidad de un determinado ion, elegido entre todos los iones del espectro obtenido en cada momento, en función del tiempo.

Registro MS: monitorización de la corriente iónica de un ion (SIM o SRM)

Cromatograma del SIM o SRM: Representa en función del tiempo la intensidad de un determinado ion -> Mayor sensibilidad y selectividad en la detección.

En SIM hay mejor sensibilidad y en SRM hay mejor selectividad.

Compatibilidad GC/MS

Ventajas: La MS es una técnica de elevada sensibilidad capaz de hacer monitorizaciones rápidas y registrar los espectros de los compuestos en fase gaseosa.

Desventajas: La MS opera a alto vacío, lo que parece incompatible con la entrada de la muestra acompañada de una cantidad elevada de gas portador.

Posibilidades de acoplamiento según el tipo de columna empleada:

Columnas Capilares: (d.i. 100-200 µm) Flujos de gas portador < 1 mL/min, tolerados por el MS

• Acoplamiento directo
• Acoplamiento en régimen abierto

Columnas Rellenas: (d.i. > 300 µm) Flujos de gas portador de 15-50 mL/min, NO tolerados por el MS

• Sistemas de enriquecimiento o separadores (en desuso)

Acoplamiento directo (regular): La columna capilar se conecta directamente a la fuente de iones.

Ventaja: Simplicidad

Inconvenientes:

1. La separación cromatográfica se ve perjudicada por el vacío del MS.
2. Necesaria interrupción del vacío al cambiar de columna.

Acoplamiento en régimen abierto (bien): La columna capilar se conecta a un dispositivo abierto a la atmósfera y barrido por un flujo de helio, el cual a su vez se conecta a la fuente de iones a través de un tubo capilar de menor diámetro que la columna.

Cromatografía Líquida acoplada a Espectrometría de Masas (LC/MS)

La LC presenta una gran incompatibilidad con la MS. LC trabaja a alta presión, temperatura ambiente y flujos de líquidos relativamente altos, utilizando tampones no volátiles. MS opera a alto vacío con gases y elevada temperatura, requiriendo tampones volátiles.

Inconvenientes:

1. Flujo de fase móvil: flujo de 1ml/min de un líquido -> miles de mL/min de gas disolvente.
2. Características de la fase móvil: Se deben sustituir los aditivos inorgánicos no volátiles por componentes volátiles, compatibles con MS.
3. Características de los compuestos analizados: Moléculas complejas de baja volatilidad, elevada polaridad y termolábiles.

GC/MS versus LC/MS

• GC/MS: los espectros por EI presentan elevada información estructural y son independientes del equipo para unas condiciones dadas (Espectro “universal” - Identificación por comparación con librería).
• LC/MS: los espectros MS por API apenas fragmentan a la molécula, dando información del ion molecular, siendo dependientes de las condiciones experimentales y equipo (Identificación haciendo uso de la especificidad de la “masa exacta” y/o selectividad de experimentos “ MS^N ”).