Espectrometria de Luminiscència i altres tècniques analítiques

Espectrometria de Luminiscència

Electrons excitats amb una font de llum, canvien d’orbital atòmic i quan deixem d’excitar-lo emet una llum diferent a l’inicial. + gran la longitud d’ona. En fred.. L’intensitat emesa és % a la concentr i a la int de llum incident. cada aparell em dóna valors diferents per tant s’ha de posar una solució patró i relativitzar-lo. Fluorescència : quan no irradiem no emet. Fosforescència: quan no irradiem segueix emeten.

FLUORESCÈNCIA

Han de ser molècules amb anells aromàtics i dobles enllaços conjugats. Luminescència és proporcional a la llum incident. L’aparell s’anomena fluorímetre.

Parts

-Font d’energia, bombeta de mercuri o de xenó (250-800nm) permet molta intensitat de llum. -Monocromador1: per estimular una molècula concreta-Cubeta: de quars i transparent: no plàstic perquè emet fluorescència. -Monocromador2: perpendicular al raig incident. Perquè no es barregi al llum incident.-Receptor

QUIMIOLUMINISCÈNCIA

Poso en contacte l’analit A amb una substància que té la capacitat de produir fluorescència (fluorocrom) B, es produeix una molècula diferent C* carregada d’energia que s’ha obtingut gràcies a una reacció química en milisegons tenim la molècula normal C i energia en forma de fluorescència. La quantitat de llum es pot relacionar amb l’analit proporcionalment. en serologia, sang en femta o sang forense. –F = + E

BIOLUMINISCÈNCIA

Reaccions metabòliques (cuca de llum)

ELECTROQUIMIOLUMINISCÈNCIA

Corrent elèctric

Dispersió de la llum

La llum surt dirigida en totes direccions degut a la interacció de la part elèctrica de la radiació electromagnètica amb els electrons dels àtoms. La dispersió s’utilitza a concentracions molt elevades o partícules molt grans (proteïnes plasmàtiques). L’angle de col·locar el detector està entre 10 i 90ºC. A 90º la dispersió era molt poca i aleshores és molt poc sensible.

Factors que afecten a la dispersió de la llum

La concentració, mida i forma, longitud d’ona i dist entre mostra i detector

Llei de Rayleigh:

1)Quan la longitud d’ona és molt superior a la mida de la partícula. dispersió superior cap al 0 i 180. 2)Quan la longitud d’ona és similar a la mida de la partícula. Major dispersió cap a la part de davant. 3)Quan la longitud d’ona és inferior a la mida de la partícula

Tècniques basades en la turbidesa de la solució

Turbidimetria

Mesura la llum transmesa i la relaciona amb la llum dispersada. La longitud molt diferent de l’absorbància. Es fa servir l’espectrofotòmetre.

Parts:

(font de llum, monocromador, cubeta, segon monocromador, detector). Aquí el detector està a 0 grauS. Disp=log 1/T Disp=k.b.c Es fa servir en longituds d’ona inferior a 340nm per immunoprecipitats, a 800nm per substàncies molt concentrades, pes molecular gros i per agregats de complex ag- ac. Tècnica poc sensible.

Nefelometria:

Tècnica mesura de la dispersió de la llum. Concentració % a llum dispersa. Nefelòmetre. La longitud d’ona que incideixo i que rebo és la mateixa. El detector entre 10 i 90º.

Components?

Font de llum (xenó, o hg), lent, monocromador, cubeta (transparent per les 4 parets), detector. If = k*Io*c. Si es posa el detector a 90 graus s’utilitza fluorímetre.

Refractometria de líquids

Es basa en el canvi de direcció de la llum quan incideix de manera obliqua, que pateix al canviar de medi. Canvis de medis molt concentrats a poc concentrat. Es fa servir per mirar la densitat o la concentració de l’orina. Abans també es feia servir per mirar densitat del plasma i del sèrum.

Llei de Snell:

N= sin i /sin r = vi / vr (compara la veloci de la llum a diferents medis) L’índex de refracció entre l’aire i un líquid és del 0,03% ... En el refractòmetre es treballa amb l’índex de refracció de la mostra i del prisma.

Fotometria de reflectància o química seca

Tires de plàstic amb un coixinet de cel·lulosa impregnat amb reactius que reaccionan amb la mostra canviant de color o no. Com mes concentr mes color. 30 microlitres i espera de 1 a 2 min. Es pot mesurar la seva reflectància i amb el refloctometre sàpiguen que A % a concentrac. Es un mètode de detecció a punt final.

Es fan servir per :

Tires d’orina Sang total, plasma o sèrum Proves bioquímiques Glucosa detecció de drogues detecció embaràs Serológiques Espectrofotòmetre de reflexió (llum tung o xen, mono, lent detect, tira) = Ir/Ie= -log A i això es % a concentra. L’avantatge principal és que és un mètode molt ràpid, l’inconvenient és que és poc sensible.

Espectrometria de masses

El que fem és obtenir ions en estat gasós. Carreguem els ions, amb una càrrega elèctrica i el passem a un estat gasós per separar-ho així en funció de la massa molecular i la càrrega elèctrica.

Avantatges

Especificitat elevada, molta sensibilitat, gran versatilitat i inconvenients cara, destrucció de la mostra, complicada.

Un aparell seria:

Maldi-Tof (maldi ionització) i (tof: anàlisi). Identificació de bacteris. El funcionament de l’espectròmetre de masses és: 1)Volatilitzar la mostra: 2)Ionització de la mostra 3)Accelerador d’ions 4)Separació d’ions 5)Detectar ions

Sistemes vaporit:

ESI (corrent mes gassos volàtils a temperatura elevada, gassos i líquids carregues – o +) Maldi (solides i momes carre + resina en suport i es sotmet al buit i a laser)

Sistema accel ions (4 tipus)

TOF (time of Flight) camp electric i electrons migran. Utilitats: determinar molècules solides, monitoritzar molècules petites a baixes concent, screening neonatal.

Tècniques cromatogràfiques

El que es fa bàsicament es separar partícules d’una solució. Es fa servir molt per proteïnes sanguínies. La separació depèn de l’afinitat del solut per les dues fases.

Fase mòbil:

Pot ser un gas o un líquid. Transportar els soluts a través de la fase estacionaria. Actua com a diluent de la mostra.

Fase estacionaria:

Pot ser un líquid o un sòlid. Retenir els soluts. placa plana o en columna.

Tipus de cromatografia:

-Segons fase mòbil: (gas o líquid) -Segons la fase estacionaria 1)Cromatografia plana: tenim una base de qualsevol polímer. Sobre aquesta base es desplaça la fase mòbil per capil·laritat, per gravetat, diferència elèctrica o polaritat. Obtenim taques. 2)Cromatografia en columna: La fase estacionaria L, S, fase mòbil G,L. per neteja de substàncies d’una solució. El que es fa és canviar el solvent i això el que fa és canviar-me el punt isoelèctric o la càrrega. Es pot recollir diferents mostres i aleshores es pot fer un cromatograma. Calcula l’àrea del pic que és proporcional a la concentració.

Segons el mecanisme físic de separació:

1)Cromatografia d’adsorció (adherir-se a la fase estacionària). 2)Cromatografia d’intercanvi iònic: separem segons la càrrega elèctrica de la molècula. La càrrega depèn del pH. Normalment és fa en columna. Anem canviant el pH fase mòbil perquè les molècules canviïn el punt isoelèctric fins arribar a un moment que no tingui afinitat per la matriu i caigui. Es fa servir per separar proteïnes i separar àcids nucleics. 3)Cromatografia d’exclusió molecular: es fa separar per mida. columna amb esferes amb un diàmetre de porus determinat. Les grans pasen ràpid les petites tarden mes. 4)Cromatografia d’afinitat: en columna. A la resina se li posen Ac que són específics per la meva molècula. Es passa la mostra per la columna i després es passa un eluent, el que fa l’eluent és netejar tot allò que no està unit a l’ac. Quan ja saps que s’ha netejat tot, canvies el pH de l’eluent, canvia la càrrega isoelèctrica i la molècula que s’havia unit a l’Ac, cau.

Tècniques electroquímiques

Serveix per mirar ions, pressions parcials d’oxigen i de diòxid de carboni i el pH. es basa en la mesura d’un senyal elèctric durant una reacció química. El sistema està format per una solució electrolítica i dos elèctrodes. L’intensitat d’electrons es % a la concentra d’ ións.

Potenciometria:

Es fa servir per el pH i la pressió parcial de co2. Mesurem la ddp entre dos elèctrodes, sempre solucions liquides i la ddp es % a la concentrac.

Parts:

1)L’elèctrode de referència: plata i està banyat en solució saturada de KCl. 2)elèctrode indicador o de treball: plata i banyat amb una solució saturada de l’ió que volem determinar. Te una membrana. 3)Potenciòmetre: mesura ddp. 4)Tipus de membrana de l’elèctrode indicador: 4.1 Membranes de vidre: compost format per òxid de sílice i òxid d’alumini. En funció de la composició del vidre em deixarà entrar alguns ions o no. Serveixen per mesurar el pH, sodi, potassi, liti, rubidi, cesi, ag i amoni (NH4). 4.2 Membranes líquides: estan formades per un polímer hidròfob amb una substància intercanviadora d’ions. Serveix per mesurar el calci, el nitrat, perclorat (HClO4). Un cas específic és l’elèctrode de CO2: És un elèctrode modificat del pH: mesurar pH a partir de l’entrada de co2 provinent de la mostra. Es fa servir molt en urgències. Amperometria: mesurar la pressió parcial d’O2 arterial. Mesura de la intensitat del corrent elèctric quan s’aplica una diferència de potencial en una solució i es produeix una reacció química. mesurar la capacitat d’una substància d’oxidar-se o reduir-se. Coulombimetria: electrons que passen Conductimetria