Enzimología: Conceptos Clave y Determinación de la Velocidad Enzimática
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Enzimología
Las enzimas son agentes catalizadores de los sistemas biológicos. Todas las enzimas son proteínas, excepto las ribozimas. Son altamente específicas y eficientes. Muchas enzimas presentan regulación de su actividad.
Sustrato
El sustrato es la molécula sobre la cual actúa la enzima. Este se une al sitio activo de la enzima formando el complejo enzima-sustrato. Luego, el sustrato se transforma en producto y es liberado del sitio activo.
Velocidad Enzimática
La velocidad enzimática se determina por:
- Cantidad de sustrato desaparecido por unidad de tiempo.
- Cantidad de producto formado por unidad de tiempo.
- Depende de la cantidad de enzima activa presente en la reacción.
Velocidad de la Reacción
Cuando la concentración de sustrato es saturante, la totalidad de la enzima se encuentra formando el complejo enzima-sustrato. La velocidad de la reacción es máxima y es directamente proporcional a la concentración total de enzima presente en el medio.
Se determina según:
- Sustratos y productos de la reacción enzimática.
- Métodos analíticos para su cuantificación.
- El método fotométrico debe obedecer la ley de Lambert-Beer.
- Curva de calibración para el método de medición.
Ensayo Enzimático
- Temperatura y Cofactores
- Amortiguador - Sustrato - Agua - Enzima
Tipos de Controles en un Ensayo Enzimático
- Blanco de Sustrato: Control que tiene todos los componentes del ensayo, excepto que el volumen del sustrato es reemplazado por un volumen equivalente de amortiguador o agua.
- Blanco de Enzima: Control que tiene todos los componentes del ensayo, excepto que el volumen de la enzima es reemplazado por un volumen equivalente de amortiguador o agua.
- Tiempo Cero: Control que tiene todos los componentes del ensayo, necesarios para la determinación de la actividad de la enzima, pero la reacción enzimática se detiene en el momento mismo de completar la adición de todos los componentes del ensayo, agregando el agente inactivador (NaOH) inmediatamente después de completar la adición del último componente de la mezcla de reacción.