Enzimas de Restricción, Plásmidos y Técnicas de Detección Molecular: Southern y Northern Blot

¿Qué es una Enzima de Restricción?

Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas de restricción, son enzimas producidas por bacterias. Actúan como un mecanismo de defensa contra infecciones víricas, degradando el ácido nucleico invasor. Estas enzimas se unen al ADN y reconocen una secuencia específica de 4 a 12 nucleótidos, denominada sitio de restricción. La enzima corta ambas cadenas de ADN dentro de esta secuencia o muy cerca de ella. El corte se produce mediante la ruptura de dos enlaces fosfodiéster en las dos hebras, generando dos extremos de ADN. Estos extremos pueden ser cohesivos (si los enlaces rotos son escalonados) o romos (si los enlaces rotos coinciden).

Estructura de un Plásmido

Un plásmido es una pequeña molécula de ADN circular que se encuentra en bacterias y se replica independientemente del cromosoma bacteriano. Los plásmidos utilizados en ingeniería genética suelen tener los siguientes componentes:

• Origen de replicación: Secuencia de ADN que permite a la bacteria iniciar la replicación del plásmido.
• Sitio de clonación múltiple (MCS): Secuencia corta de ADN que contiene varios sitios de restricción. Estos sitios son reconocidos por las correspondientes enzimas de restricción, permitiendo la inserción de genes específicos.
• Promotor: Secuencia de ADN ubicada antes del gen insertado. Permite a la ARN polimerasa comenzar la transcripción del gen.
• Gen marcador de selección: Gen que codifica para la resistencia a un antibiótico. Permite seleccionar las células que contienen el plásmido (transformadas) utilizando un medio de cultivo selectivo que contenga el antibiótico.

Método Southern Blot para la Detección de ADN

El método Southern Blot, desarrollado por Edwin Southern, se utiliza para detectar genes específicos en el ADN celular.

1. El ADN se digiere con una enzima de restricción, generando fragmentos de diferentes tamaños.
2. Estos fragmentos se separan por tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa.
3. Los fragmentos de ADN de doble cadena se desnaturalizan químicamente, separándolos en hebras sencillas.
4. El ADN del gel se transfiere a un filtro de nitrocelulosa o nailon. Esta transferencia crea una réplica de la disposición de los fragmentos de ADN en el gel.
5. El filtro se incuba con una sonda marcada (generalmente con fluorescencia o radiactividad). La sonda es una secuencia de ADN o ARN complementaria a la secuencia diana que se quiere detectar.
6. Durante la incubación, la sonda se hibrida (se une) a las moléculas de ADN de cadena sencilla que tienen una secuencia complementaria.
7. La sonda hibridada se visualiza exponiendo el filtro a rayos X (si la sonda es radiactiva) o mediante detección de fluorescencia (si la sonda es fluorescente).

Método Northern Blot para la Detección de ARN

El método Northern Blot se utiliza para identificar cadenas de ARN con secuencia complementaria a una sonda de ADN o ARN.

1. El ARN se extrae de las células o tejidos.
2. El ARN se fracciona por tamaño mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (para mantener las cadenas de ARN separadas).
3. El ARN del gel se transfiere a un filtro de nitrocelulosa o nailon, creando una réplica de la disposición de los fragmentos de ARN.
4. El filtro se incuba con una sonda marcada (fluorescente o radiactiva).
5. La sonda se hibrida a las moléculas de ARN de cadena sencilla con secuencia complementaria.
6. La sonda hibridada se visualiza de forma similar al Southern Blot (rayos X o fluorescencia).

Enzimas Utilizadas en la PCR y su Justificación

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) es una técnica que amplifica exponencialmente una región específica de ADN. Las enzimas clave utilizadas son:

• Taq polimerasa: Esta ADN polimerasa es termoestable, lo que significa que es estable a altas temperaturas. Esto es crucial porque la PCR implica ciclos repetidos de calentamiento (hasta 95°C para la desnaturalización del ADN) y enfriamiento. La Taq polimerasa no tiene actividad correctora de errores (actividad exonucleasa 3'→5').
• Pfu polimerasa: Esta polimerasa es aún más termoestable que la Taq polimerasa (temperatura óptima cercana a 100°C). Además, posee una importante función correctora de errores (actividad exonucleasa 3'→5'), lo que reduce la tasa de errores durante la amplificación. Se utiliza cuando se requiere alta fidelidad en la copia del ADN.

La elección de la enzima depende de la aplicación específica de la PCR. Si la fidelidad es crítica (por ejemplo, en clonación o secuenciación), se prefiere la Pfu polimerasa. Si la velocidad y el costo son más importantes, la Taq polimerasa es una opción común.