Enzimas: Propiedades Clave, Medición de Actividad y Factores Experimentales

Introducción a las Enzimas

Las enzimas son proteínas que aceleran las reacciones químicas hasta alcanzar su punto de equilibrio.

Ecuación General de las Enzimas

La ecuación general de las enzimas se representa comúnmente como:

E + S ⇇ ES → E + P

Donde:

• E: Enzima
• S: Sustrato
• ES: Complejo Enzima-Sustrato
• P: Producto

Nota: La notación original "C' --C>>" es una representación informal de la catálisis enzimática.

Medición de la Actividad Enzimática

La actividad enzimática se manifiesta y se mide por:

• Desaparición del sustrato.
• Formación del producto.
• Modificación del cofactor.

Factores que Modifican la Actividad Enzimática

Los principales factores que modifican la actividad enzimática son:

• pH
• Temperatura
• Concentración de sustrato
• Concentración de enzima
• Tiempo de incubación

Observación Práctica: Pepsina y Albúmina

En la práctica, se observa el efecto de la pepsina sobre la albúmina del huevo.

La actividad enzimática se apreciará por la pérdida de la turbidez proteica.

La actividad enzimática se reporta en función del porcentaje de formación de producto, para lo cual se utiliza la siguiente ecuación:

% Formación de producto (FP) = 100 - (Absorbancia de los tubos / Absorbancia de la albúmina) * 100

Donde:

• Absorbancia de los tubos: Absorbancia de los tubos después del incubado.
• Absorbancia de la albúmina: Absorbancia de la albúmina (Abs = 0.995).

Experimentos sobre la Actividad Enzimática

3. Experimento: Efecto del pH

El pH actúa sobre los grupos ionizados que pertenecen a los centros activos de las enzimas. Los grupos que pierden su ionización pierden la capacidad de interaccionar con el sustrato. Cada enzima tiene un pH óptimo de trabajo.

Preparación de Tubos para el Experimento de pH:

• pH
• mL de albúmina
• mL de HCl 1N
• mL de Na₂CO₃
• mL de agua destilada

Procedimiento:

1. Preincubar los cinco tubos más un tubo conteniendo 20 mL de pepsina al 1% a 37°C por 5 minutos.
2. Luego, añadir 3 mL de la pepsina preincubada a cada uno de los tubos 1-5.
3. Mezclar e incubar a 37°C por 10 minutos.
4. Observar la diferencia o leerla en un fotocolorímetro con filtro azul.

4. Experimento: Efecto de la Temperatura

Todo aumento de temperatura incrementa la actividad enzimática por un aumento de la energía de activación. Sin embargo, paralelamente se produce una desnaturalización parcial de la enzima que la inactiva.

Preparación de Tubos para el Experimento de Temperatura:

• Preparar 5 tubos con: Albúmina, HCl 1N, Agua destilada.
• Preparar otros 5 tubos con: Pepsina 1%.

Procedimiento:

1. Incubar los primeros 5 tubos (albúmina, HCl, agua) por 5 minutos de acuerdo al siguiente esquema de temperatura: 37°C, 70°C, 37°C y 100°C.
2. Agregar los respectivos tubos N° 6 al N° 10 (pepsina) a los tubos pre-incubados (N° 1-5) y continuar la incubación a las temperaturas correspondientes.

5. Experimento: Efecto de la Concentración de la Enzima

Aunque las enzimas no se destruyen con las reacciones, el aumento de su concentración en la cubeta de reacción incrementa la velocidad.

Preparación de Tubos para el Experimento de Concentración de Enzima:

• Preparar 5 tubos con: Albúmina, HCl 1N, Agua destilada, Pepsina.

Procedimiento:

1. Incubar los 5 tubos a 37°C por 5 minutos y enseguida añadir [sustrato/reactivo adicional, según el protocolo completo].
2. Incubar por cinco minutos adicionales a 37°C.
3. Observar en el fotocolorímetro a 420 nm, contra una lectura de agua.

6. Experimento: Efecto de la Concentración del Sustrato

Si en una reacción enzimática incrementamos progresivamente la concentración del sustrato, la velocidad enzimática aumentará hasta un punto en que la velocidad llega a una meseta plana que no se modifica aunque sigamos aumentando el sustrato; en ese punto, habremos saturado la enzima.