Enzimas para la manipulación del ADN

Tema 5:ENZIMAS PARA MANIPUACION DEL ADN: Contar: endonucleasas de restricción, sirven para proteger a la bacteria contra la entrada de DNAs foraneos.

Pegar: DNA ligasa. Copiar: DNAàDNA: ADN Polimerasa, RNAàDNA: transcriptasa reversa, DNAàRNA: RNA polimerasa. PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCION: Secuencias simetricas de 4 a 8 nucleotidos que poseen un eje de simetría. Estos enzimas reconocen y cortan en su sitio de reconocimiento, en el DNA de cualquier organismo. Extremos generados: pueden ser nomos o protuberantes. Isosquizomeros: Dos enzimas distintas reconocen la misma secuencia, pueden contar en distintos sitios o en el mismo. Extremos compatibles: Enzimas que reconocen secuencias distintas pero dejan extremos que son complementarios entre si. Clonacion en el fago: Una biblioteca en el fago infectan a distintos fagos con todo tipo de genes. Este proceso se hace invitro. Se infecta E-coli con un fago defectuoso que no contiene una proteina  necesaria para empaquetar el DNA dentro de la cabeza. Preparación de cabezas vacias y colas. SE mezcla el DNA recombinante con la proteina A y la preparación de cabeza vacia y colas. Producción de pantialo del fago 1 con DNA genomico listo para infectar, E-coli. Puedes colocar una proteina a la cadena de Adn para que adquiera florescencia. –Efecto de metilacion: Algunas enzimas de restricción no cortan cuando una base en sus secuencia esta metilada.  TAMPÓN: La mayoria de enzimas trabajan a 37º, Se necesita el tampón adecuado, es decir la cantidad adecuada de agua y sales correcta, el BSA forma parte del tampon, ocupa el 10% y sirve para proteger la proteina. Unidad de actividadàCantidad de enzima que digiere completamente 1mg de DNA en un volumen de 20 o 50 ml durante una 1h en condiciones optimas.

 DNA LIGASA:Todos los seres vivos tienen ligasa porque actua en la replicación y reparacion del adn. La unica condicion es que sean o extremos compatible o extremos nomos para poder unirse. (Para que se produzca la reaccion de ligamento tiene que darse la reaccion.)

  FRAGMENTO DE KLENOW: Tiene actividades DNA polimerasas y exonucleasas 3’à5’ y se utiliza en la ingenieria genetica para tres tipos de reacciones: síntesis del adn de doble cadena a partir DNA de simple cadena, relleno de fragmentos de dna con extremos de 5’ protuberantes, digestión de extremos 3’ protuberantes. TRANSCRIPTASAS REVERSAS (RNAàDNA): Son enzimas que funcionan como DNA polimerasas dependiente de RNA. Son codificados por retrovirus y se utiliza para copiar el genoma de RNA virico a DNA antes de su integración en el genoma huésped. Se usan para generar DNAs complementarios de RNAs mensajeros o para generar una copia de DNA de un RNA. RNA POLIMERASAS (DNAàRNA) Son dependientes del DNA derivan de fagos y se usan para generar RNAs definidos de un molde de DNA en esa reaccion de transcripcion invitro. Estos RNAs se usan para estudios de traducción invitro o para estudiar la funcion y estructura del RNA sintetizado. KINASAS: La polinucleotido Kinasa cataliza la transferencia de un fosfato de ATP a un estremo de 5’ de DNA o RNA. Se utiliza en la reaccion de fosforilacion directa, la kinasa transfiere el fosfato gamma del ATP al extremo 5’. La kinasa se puede utilizar en la fosforilacion de fragmentos de DNA antes de esa reaccion de ligacion que requiere en fosfato 5’ y en el marcaje de oligonucleotidos con radioactividad para su uso como sondas. FOFATASAS: La fosfatasa alcalina quita el grupo fosfasto 5’ d DNA y RNA. Tambien funciona para nucleotidos y proteinas. Es mas activo a PH alcalino. Las fosfatas alcalinas se usan para quitar fosfato 5’ de plasmados y fagos que se van a utilizar para clonar fragmentos de DNA. Esta reaccion evita la ligacion entre los dos extremos del plasmado o fago y por tanto facilita la invencion de otros fragmentos de interés o para quitar fosfato 5’de fragmentos de DNA antes de marcar el extremo con fosfatos radioactivos. NUCLEASAS: Normalmente en la ingenieria genética estos enzimas son el enemigo ya que degradan el DNA o RNA. Pero en algunos casos, estos enzimas son imprescindibles