Ensayo de esterilidad y pruebas de sensibilidad antimicrobiana

TP9: Ensayo de esterilidad

Se realiza con la finalidad de determinar la ausencia de MO en los lugares de fabricación como en los medicamentos. Los objetivos son:

• Determinar el número de MO presentes
• Lograr la inhibición del MO
• Determinar la presencia de conservantes

OBJETIVOS:

• Reconocer la importancia del control higiénico de medicamentos
• Interpretar los criterios microbiológicos utilizados
• Verificar si el medicamento analizado se ajusta a la normativa vigente
• Realizar control de esterilidad del medicamento, control general, inactivación del conservante, pruebas definitivas
• Poner en práctica diferentes técnicas microbiológicas: vertido en placa, inoculación de microorganismos de prueba, etc.

TP8: KIRBY BAUER

El M.O. es inoculado en la superficie de una placa de agar, sobre el cual se colocan discos impregnados con una concentración conocida del antibiótico. Las placas se incuban por 16-18 horas a 35-37° C. Durante la incubación, el antibiótico difunde radialmente desde el disco a través del agar, por lo que su concentración va disminuyendo a medida que se aleja del disco. En un punto determinado, la concentración del antibiótico en el medio es incapaz de inhibir al germen en estudio. El diámetro del área de inhibición alrededor del disco puede ser convertido a las categorías de sensible, intermedio o resistente (S, I, o R) de acuerdo a tablas publicadas por los organismos encargados del control de tales métodos. Dado que las pruebas de sensibilidad in vitro dan solamente una idea aproximada de la acción inhibitoria contra los microorganismos, es necesario tener presente que la verdadera respuesta de estos ante los antibióticos es la respuesta clínica del paciente luego de administrada la dosis adecuada del mismo. Las pruebas de sensibilidad se indican para cualquier M.O causante de un proceso infeccioso que necesite tratamiento antimicrobiano, y cuya sensibilidad no puede ser predecida. Existen M.O que muestran sensibilidad variable a los antibióticos de uso común: Estafilococos, Enterobacterias, Pseudomonas, Enterococos y algunos bacilos Gram (-) no fermentadores de glucosa. Debe realizarse el antibiograma con cepa pura, utilizando varias colonias de aspecto semejante del germen a probar.

Cultivos para anaerobios

Agar sangre (sólido) y tioglicolato (líquido) deben ser enriquecidos porque los anaerobios no utilizan el O como energía.

CIM (concentración inhibitoria mínima)

Diferencias de CIM con Kirby Bauer:

• El CIM es de dilución y en cambio K.B es de difusión.
• Es más costoso y complejo, y lleva más tiempo.
• La ventaja del CIM es que se obtiene la mínima concentración con la que se inhibe el crecimiento, mientras que K.B solo indica si es sensible o resistente a esa concentración que tiene el disco con ATB.

CATEGORÍA 1

Productos para ser aplicados sobre escaras, ulceraciones o quemaduras graves. Ausencia de gérmenes revivificables. Recuento de aerobios viables totales: no más de 10 por gr o ml. Ausencia de Enterobacteriaceae en un gr o ml. Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en un gr o ml. Ausencia de Staphylococcus aureus en un gr o ml.

CATEGORÍA 2

Productos para ser administrados por vía nasal, ótica, rectal, tópica y vaginal. Recuento de aerobios viables totales: no más de 10^2 por gr o ml. Ausencia de Entobacteriaceae en un gr o ml. Ausencia de Pseudomonas aeruginosa en un gr o ml. Ausencia de Staphylococcus aureus en un g o ml.

CATEGORÍA 3

Productos para ser administrados por vía oral. Recuento de aerobios viables totales: no más de 10^3 por gr o ml. Recuento de hongos y levaduras no más de 10^2 por gr o ml. Recuento de Enterobacterias no más de 10^2 en un gr o ml. Ausencia de Pseudomonas aeruginosa (solamente en productos farmacéuticos orales líquidos) en un ml. Ausencia de Staphylococcus aureus en un gr o ml. Ausencia de Escherichia coli en un gr o ml. Ausencia de Salmonella en un gr o ml (productos farmacéuticos cuyas materias primas se consideren fuentes de contaminación). Ausencia de anaerobios sulfitoreductores en un gr o ml.

Recuento estándar de MO

Aerobios: en placa, PCA, 2-7 días, 35°C; Anaerobios: líquido, Tioglicolato, 2-7 días, 35°C; Hongos: placa, Sab, 2-7 días, 30°C.

PREPARACIÓN DE LA INOCULACIÓN

Se toman 2 a 3 colonias bien aisladas con un ansa, y se introducen en 5 ml de caldo de triptona soya. Se pretende obtener la turbidez del testigo (0,5 de la escala Mc Farland).

PREPARACIÓN DE LAS PLACAS CON EL MEDIO DE CULTIVO según Kirby Bauer

Debe utilizarse Agar de Mueller Hinton, no otro. El pH es de 7,2 a 7,4. Este agar es el más indicado porque:

• Presenta buena reproducibilidad de resultados lote a lote.
• Es pobre en contenido de timina (compiten con las sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclinas, lo que daría falsas resistencias).
• Brinda buen crecimiento a muchos patógenos.
• Se encuentran gran cantidad de datos sobre pruebas de sensibilidad con este medio.

Deben verterse por placa de 25 a 30 ml de agar fundido para obtener una altura de 4 mm. Esto es importante para no obtener halos excesivamente reducidos o ampliados. Preparadas y envueltas, pueden conservarse de 4 a 7 días en la heladera. Para evitar las gotas de condensación en la superficie del agar, secar las placas de 15 a 30 minutos invertidas en estufa a 37ºC antes de la siembra.

ANTIBIOGRAMA

Se toman 2 a 3 colonias puras con el ansa ojal y se diluye en caldo de triptona soya hasta 0,5 escala Mc Farland de turbidez. Esquema: 1. Se toma la colonia pura de una caja de Petri, 2. Se diluye hasta turbidez 0,5, 3. Se toma un hisopo y se escurre en la pared el exceso, 4. Se realiza el hisopado 3 veces girando a cada 60º, 5. Se agregan los monodiscos de antibiótico. Las causas de error son no conseguir la turbidez, no trabajar con los conceptos de esterilidad, agregar más o menos de los 4 mm del agar.

Tioglicolato

Para MO anaerobios, es indicador (rezorzurina en presencia de O cambia a rosa), glucosa como fuente de energía, pequeña cantidad de agar (evitar difusión de CO2 y O2). Se agrega vaselina para mantener el ambiente anaeróbico.

TP7: Aerobios estrictos

Requieren presencia de O para su desarrollo (pseudomona).

Anaerobios estrictos

Requieren la ausencia de O para su desarrollo (salmonella).

Anaerobios facultativos

Son aquellos que pueden desarrollarse aun en la presencia de O (staphylococus aureus).

Microaerófilos

Son aquellos que requieren pocas concentraciones de O (streptococus) y se cultivan en la lata con vela.

Esputo: Tinción directa

Gram (observación de flora y leucocitos).

Cultivo

1. Agar sangre: 35-37°C, 18-24 horas, cocos gram (+): Prueba de catalasa: (+) Staphylococcus aureus; (-) Streptococcus pneumoniae, bacilos gram (-): Prueba de oxidasa: (+) Pseudomonas; (-) Enterobacterias. 2. Agar chocolate: Haemophilus influenzae. 3. Gas Pack: abrazadera, catalizador de paladio, sobre generador de anaeróbicos, placas: agar sangre.