Enginyeria Genètica: Tècniques, PCR, Teràpia i CRISPR

Tècnica del DNA recombinant

La clonació molecular és una tècnica d’enginyeria genètica que permet:

• Copiar un fragment específic d’ADN (normalment un gen).
• Introduir-lo en un altre organisme.
• Obtenir moltes còpies o fer que produeixi una proteïna.

Passos:

1. Aïllar el gen d’interès.
2. Inserir-lo en un vector (plasmidi, virus…).
3. Introduir-lo en una cèl·lula hoste.
4. Replicar-lo i expressar-lo.

L'objectiu és construir molècules d’ADN combinant fragments de diferents organismes.

Tall del DNA

Es fa amb enzims de restricció (endonucleases) que tallen en seqüències específiques i generen extrems cohesius (enganxosos), complementaris entre si.

Unió dels fragments

Es tallen el DNA del gen d’interès i el del vector amb el mateix enzim. Els extrems cohesius s’aparellen i la DNA ligasa uneix definitivament els fragments.

Vectors de clonació

Són molècules d’ADN capaces d’entrar a una cèl·lula i replicar-se:

• Plasmidis bacterians: els més utilitzats per a fragments petits.
• Bacteriòfags.
• BAC: cromosomes bacterians artificials.
• YAC: cromosomes artificials de llevat.

Els plasmidis

Són ADN circular que es replica dins bacteris. Entren per transformació; el bacteri que incorpora el plasmidi s’anomena bacteri transformat.

Selecció de bacteris transformats

Els plasmidis porten gens marcadors (resistència a antibiòtics). Només sobreviuen els bacteris que han incorporat el plasmidi en un medi amb antibiòtic.

Cas especial: Agrobacterium tumefaciens

Bacteri del sòl que infecta plantes. Té el plasmidi Ti (tumor), que conté el T-DNA, el qual s’integra al cromosoma vegetal i provoca tumors. En enginyeria genètica, s’eliminen els gens tumorals i el plasmidi Ti s’utilitza com a vector de clonació en plantes.

La PCR

La PCR (Reacció en Cadena de la Polimerasa) permet amplificar un fragment concret d’ADN, és a dir, obtenir-ne milions de còpies en poques hores.

Components necessaris

• ADN motlle: fragment que volem amplificar.
• Encebadors (primers): seqüències curtes complementàries als extrems 3’ del fragment.
• DNA polimerasa: com la polimerasa aïllada del bacteri Thermus aquaticus.
• Desoxiribonucleòtids.

Etapes del cicle de PCR

1. Desnaturalització (90–100 °C): se separen les dues cadenes d’ADN.
2. Hibridació (50–65 °C): els encebadors s’uneixen a les seqüències complementàries.
3. Elongació (70–72 °C): la DNA polimerasa sintetitza les noves cadenes.

Després de 24-40 cicles s'obtenen milions de còpies.

Visualització: Electroforesi

Després de la PCR, els fragments es separen per electroforesi en gel d’agarosa. Els fragments més petits migren més ràpid, la qual cosa permet saber la mida del fragment amplificat.

PCR en virus d’RNA (exemple COVID)

El virus SARS-CoV-2 té RNA. Com que la PCR només amplifica ADN, primer cal fer una transcripció inversa (RT) i després la PCR normal.

Aplicacions de la PCR

• Biologia evolutiva: ADN de mamuts, humans primitius, arbres filogenètics.
• Diagnòstic mèdic: malalties hereditàries, diagnòstic prenatal, detecció de virus/bacteris.
• Medicina forense: proves de paternitat, anàlisi de sang, cabells, saliva.
• Estudis d’expressió gènica: mesurar quant s’expressa un gen.

🎯 Resum per a les PAU: La PCR és una tècnica que permet amplificar un fragment específic d’ADN mitjançant cicles repetits de desnaturalització, hibridació i elongació en un termociclador. Utilitza encebadors específics i una DNA polimerasa.

Teràpia gènica

La teràpia gènica consisteix a introduir un gen funcional dins les cèl·lules d’un pacient per substituir o compensar un gen defectuós. S’utilitza sobretot per tractar malalties hereditàries, immunològiques o alguns càncers.

Fonament

Es modifica un virus no patogen (se li elimina la capacitat de causar malaltia) i s’hi insereix una còpia correcta del gen humà. El virus actua com a vector, s’introdueix a les cèl·lules del pacient i aquestes comencen a produir la proteïna funcional.

Tipus de teràpia gènica

• Ex vivo: s’extreuen cèl·lules del pacient, es modifiquen al laboratori i es tornen a introduir. (Més controlada).
• In vivo: el vector viral s’injecta directament al pacient. (Més senzilla).

CRISPR-Cas9

És un sistema d’edició genètica que permet tallar l’ADN en un punt concret. Deriva d’un mecanisme natural de defensa dels bacteris contra virus bacteriòfags.

Components

• RNA guia: reconeix la seqüència específica.
• Cas9: endonucleasa que talla la doble cadena d’ADN.

Mecanismes de reparació

• NHEJ (reparació imperfecta): afegeix o elimina nucleòtids aleatòriament. S’utilitza per inactivar gens.
• HDR (reparació dirigida): utilitza un DNA motlle correcte per substituir un gen defectuós.

Resum de conceptes clau:

• PCR: copiar ADN.
• Teràpia gènica: afegir un gen correcte.
• CRISPR: tallar i editar un gen específic.
• ADN recombinant: combinar ADN de diferents organismes.