Enginyeria d'Anticossos: Genoteques de Fags i Teràpies CAR-T

Genoteques Combinatòries de Fags

Generació de Llibreries scFv

Partim de limfòcits B (LB) humans de sang perifèrica o de LB animals (immunitzats o no contra l'antigen d'interès). D'aquests LB, obtenim l'mRNA. Com que l'mRNA és poliadenilat, hibridem amb un oligo-dT per generar el cDNA.

A partir d'aquest cDNA, amplifiquem per PCR les regions variables lleugeres (VL) i pesades (VH), generant totes les combinacions possibles. Les PCR de VL i VH s'obtenen gràcies a que les seqüències flanquejants d'aquestes regions són constants, permetent el disseny de primers. El resultat de la PCR és l'obtenció d'un mínim de 10¹⁷ fragments VH i 10¹⁷ VL.

La qüestió és: com se separen i es combinen? Es barregen VH i VL, i es construeix un pèptid enllaçador (linker) de 15 aminoàcids entre elles. Això es realitza mitjançant PCR amb primers que contenen solapaments, per generar el linker entre els fragments VL i VH. Així, es combinen les 10¹⁷ VL possibles amb les 10¹⁷ VH possibles, resultant en 10³⁴ combinacions potencials de scFv (single-chain variable fragment).

Un cop generada la seqüència VH-linker-VL (scFv), es pot amplificar per PCR utilitzant primers que incorporen dianes de restricció apropiades per a la posterior clonació d'aquest fragment en un vector fàgic (fagèmid). La clonació es fa en un fagèmid que conté: un origen de replicació (Ori) de plasmidi bacterià, un gen de resistència a ampicil·lina (Amp) i un Ori de fag.

En aquest fagèmid, es clona el fragment scFv, juntament amb un promotor i un tag, i es fusiona a la proteïna pIII del fag. Aquest vector es transforma en bacteris que, mitjançant un fag helper, començaran a sintetitzar fags que expressen els scFv a la seva superfície (cua), ja que és on es troba la proteïna pIII. L'únic inconvenient és que la pIII es troba en poques còpies al fag, però això és suficient per a la selecció. Cada fag presentarà un scFv diferent, ja que cada fagèmid contindrà una combinació de scFv diferent.

A més, es pot utilitzar la mateixa aproximació afegint els dominis constants: amb VH-CH-VL-CL. Aquests fags són filamentosos. Alternativament, s'ha utilitzat la proteïna pVIII del fag en lloc de la pIII per generar les proteïnes de fusió. L'avantatge és que hi ha més còpies, però el problema és la mida de la proteïna a clonar, que no pot ser gaire gran, ja que altrament el fag i la seva coberta no s'estructuren correctament.

Selecció de Fags per Afinitat (Panning)

A continuació, cal seleccionar, de tots els fags possibles, aquell que contingui l'scFv d'interès, el que reacciona contra l'antigen (Ag) desitjat. Existeixen diferents sistemes de selecció.

Es prenen els fags obtinguts per clonatge i se'ls sotmet a interacció amb l'Ag. Només els scFv específics s'uniran (alguns s'uniran inespecíficament, per la qual cosa cal realitzar elucions). S'afegeix un tampó amb força iònica, de manera que els anticossos (Ab) units per interaccions febles eluiran. Només romandran els Ab amb alta afinitat per l'Ag.

Aquests fags s'amplifiquen mitjançant infecció en cultius bacterians. El procés es repeteix, passant els fags seleccionats de la cromatografia d'afinitat o ELISA anterior, i es repeteix 6 o 7 vegades. Un cop obtinguts els fags que codifiquen els millors scFv, es tornen a amplificar en bacteris mitjançant una infecció. Posteriorment, es seqüencia el seu material genètic per determinar les seqüències dels scFv.

Es poden obtenir diverses seqüències de scFv (diversos Ab bons possibles), i en aquest cas caldria estudiar quina scFv té la millor afinitat per l'Ag; o potser només s'obté una seqüència.

Aplicacions de les Genoteques de Fags

• Seleccionar, humanitzar i madurar anticossos específics in vitro o in vivo.
• Seleccionar mimotops d'interaccions entre proteïnes extracel·lulars (p. ex., pèptids que s'uneixen a la proteïna gp120 del VIH, que inhibeixen la interacció amb CD4).
• Seleccionar pèptids que s'uneixen específicament a un tipus cel·lular o a un teixit (lligands per a antígens específics de membrana, antígens tumorals, etc.).
• Mapejar residus crítics per a la interacció proteïna-proteïna.
• Seleccionar inhibidors enzimàtics.
• Seleccionar mimotops d'hormones peptídiques (p. ex., EGF).
• Identificar lligands per a anticossos específics per a certes malalties (p. ex., malalties autoimmunes, malalties infeccioses).

Enginyeria d'Anticossos

Anticossos Quimèrics

Es poden clonar els diferents VH i VL en vectors d'expressió que ja contenen els fragments constants dels anticossos (tant de les cadenes pesades com lleugeres) per als diferents isotips humans. Així es generen anticossos quimèrics. L'objectiu d'aquesta aproximació és evitar el rebuig humà als fragments constants dels anticossos d'animals.

Alternativa: Generació de mAb sense Hibridoma

Alternativa: hybridoma-free generation of mAb. Es tracta d'un ratolí transgènic que porta l'antigen tumoral major del virus SV40 (AgT), sensible a la temperatura, sota el control d'expressió del promotor de ratolí dels gens del MHC. Aquest antigen fa que si els limfòcits B l'expressen, esdevinguin cèl·lules tumorals. Així, es poden obtenir cèl·lules immortals de forma condicionada a temperatures permissives (33°C) i obtenir anticossos monoclonals. És a dir, les cèl·lules B es convertirien per si soles en hibridomes quan s'apliqués la temperatura adequada. No obstant això, aquesta tècnica no s'ha utilitzat gaire.

Anticossos Humanitzats

Aquí, tot l'anticòs és humà, a excepció de les regions hipervariables (CDR), que són d'origen murí. A partir de les genoteques de fags, que indiquen les combinacions variables correctes, es substitueixen directament els CDR d'un anticòs humà mitjançant PCR i mutagènesi dirigida amb primers. És un remodelatge d'estructura de seqüència. Així, es generen anticossos humans amb els CDR modificats, d'acord amb la informació de la seqüència dels millors fags obtinguts.

Aquest va ser un projecte al qual es van dedicar milions d'euros. Fins que es va inventar una nova tècnica: els anticossos humans.

Humanització d'Anticossos: Inserció de CDRs

Inserció de CDRs concrets en els anticossos. Es realitzen PCRs seqüencialment, amplificant progressivament la cadena i afegint els CDRs, fins a obtenir tot el domini, on s'han substituït els CDR inicials pels CDR específics d'interès. Com a seqüència humana d'anticòs acceptora es poden utilitzar moltes, idealment una seqüència similar a la del pacient.

Després de tenir la cadena definitiva, cal realitzar mutacions puntuals als framework regions (FR) per assegurar que l'estructura s'uneixi correctament a l'epítop:

• La inserció de CDRs murins en models d'anticossos humans (REI, NEWM) sovint comporta la pèrdua d'afinitat de l'anticòs pel seu antigen.
• Això es deu al fet que determinats residus de les regions estructurals (FR) participen i influeixen en l'estructura del CDR i el seu contacte amb l'epítop.
• Per mantenir aquesta afinitat, sovint és necessari retocar i optimitzar les FR.
• Les afinitats d'interacció s'estudien in silico, comparant les orientacions d'unió.

Anticossos Humans

Consisteix en la creació de ratolins transgènics que codifiquin les seqüències per produir anticossos humans. Es denominen humans, però no provenen d'humans, sinó de ratolins que codifiquen les cadenes dels anticossos humans.

El primer anticòs humà obtingut d'aquesta manera va ser un anticòs contra el receptor EGFR, important per al càncer de mama. Avui dia, només s'utilitzen els anticossos humans, i se n'han generat de molts tipus i amb moltes especificitats diferents.

Terminologia dels Anticossos

Isotípics

Es troben a la regió constant i distingeixen cada classe i subclasse d'immunoglobulina (Ig) dins d'una espècie.

Al·lotípics

Són diferències subtils en la seqüència d'aminoàcids codificades pels diferents al·lels dels gens de cada isotip. Les diferències al·lotípiques es poden detectar comparant la mateixa classe d'anticossos entre diferents soques.

Idiotípics

Es generen per la conformació de la seqüència d'aminoàcids de la cadena pesada i lleugera de la regió variable específica per a cada antigen. Cada determinant individual s'anomena idiotop i la suma de tots els idiotops és l'idiotip.

Teràpies CAR-T Convertibles

El Problema de les CAR-T Convencionals

Un dels problemes de les teràpies CAR-T convencionals és que generen una immunodeficiència en tots els limfòcits B, ja que l'anticòs utilitzat en el cas de curar les leucèmies és l'anti-CD19. Per tant, eliminen les cèl·lules leucèmiques, però també els altres limfòcits B que expressen CD19.

Solució: CAR-T Convertibles

Per evitar aquest problema, s'ha desenvolupat la següent aproximació: Les cèl·lules T citotòxiques (CTLs) tenen un receptor, el NKG2D, el lligand del qual és la MICA, una molècula MHC I no clàssica, sense la β2-microglobulina. A partir d'això, es va generar un receptor NKG2D mutant que, en lloc de reconèixer el lligand MICA de tipus salvatge (wt), només es pot unir a un lligand mutant dissenyat per nosaltres.

Així, es generen anticossos específics per a l'antigen desitjat que incorporen un domini del lligand mutant al final de les seves cadenes. D'altra banda, es generen cèl·lules CAR-T convertibles, que són limfòcits T (LT) amb els receptors NKG2D mutants i, per tant, reconeixen aquests anticossos amb el domini del lligand mutant.

Imaginem una teràpia per al VIH. Si no hi hagués aquest anticòs, la cèl·lula T no faria res, ja que el receptor no s'activaria, perquè només s'activa amb el lligand mutant, que no està present de forma natural al cos. Aleshores, quan es produeix el reconeixement, s'activa el CTL i mata la cèl·lula que li proporciona el lligand, que és una cèl·lula infectada per VIH, ja que presenta antígens a la seva superfície que són reconeguts per aquests anticossos mutants dissenyats. S'anomenen cèl·lules CAR-T convertibles perquè només s'activen quan interaccionen amb l'anticòs generat.

Amb aquest sistema, només s'eliminen les cèl·lules infectades pel virus, no totes les cèl·lules B. A més, es generarà una memòria i tota la resposta immunitària adequada. No obstant això, la memòria dependrà del pacient. De vegades podria durar poc, i aquest tractament s'ha d'aplicar durant diversos anys.

Cal recordar que els tractaments amb CAR-T s'apliquen a pacients refractaris a tots els tractaments clàssics contra el càncer que no han funcionat. Per tant, aquesta és l'última alternativa i funciona raonablement bé. Si hi ha un altre tumor, no cal tornar a generar les cèl·lules CAR-T convertibles; només caldria un nou anticòs perquè reconegui un altre antigen. Per tant, es pot fer el switch-on i off per a diferents antígens.

Cal tenir en compte que, sense les cèl·lules CAR-T convertibles, amb les cèl·lules CAR-T normals, s'estan eliminant cèl·lules del sistema immunitari (SI), i per tant, mentre s'apliqui el tractament, s'estarà immunosuprimit, però és una qüestió de triar entre això o la mort.