Electroforesis y Técnicas de Separación en Química: Un Enfoque Completo

Electroforesis en Gel de Agarosa

Electroforesis en Gel de Agarosa: Se utiliza para la separación de fragmentos de ADN. Se prepara la disolución con la muestra en el mismo tampón que usaremos en la electroforesis.

• Se prepara el gel y se hacen pocillos de siembra con un peine.
• Tampón: Tris-acetato y TBE.
• Sustancia reveladora: emite fluorescencia cuando se ilumina con luz UV.
• Tampón de carga: es la solución en la que se disuelven las muestras antes de cargarlas en el gel.

Contiene:

• Colorante de rastreo: para ver el rastreo.
• Glicerol o ficoll: hace que la muestra sea más densa y se hunda bien.
• Tampón adecuado: mantiene la estabilidad del ADN, ARN y proteínas.

Electroforesis en Gel de Poliacrilamida (PAGE)

• Se utiliza para la separación de proteínas, pequeños fragmentos de ADN y la mayoría de los ARN.
• Soporte de acrilamida y bisacrilamida.
• Electroforesis vertical.
• A las muestras se les adicionan: tampón, glicerol y marcadores electroforéticos.

Modalidad en geles de gradiente: la concentración de acrilamida aumenta progresivamente en sentido descendente.

Tipos de PAGE

• En condiciones NO desnaturalizantes: no se altera la conformación nativa de las proteínas.
• En condiciones desnaturalizantes: las proteínas pierden su estructura nativa en presencia de agentes desnaturalizantes, que se incluyen en el tampón y en los geles.

SDS PAGE

• Es la electroforesis más utilizada.
• Es muy rápida.
• La separación depende de la masa molecular.
• Se utilizan marcadores de peso molecular.

Electroforesis de Acetato de Celulosa

• Se utiliza para la electroforesis de proteínas plasmáticas.
• Se usan tiras comerciales que se hidratan 10 minutos en solución tampón y se secan en papel de filtro.
• Tampón de carga.

• Colorante: azul de Coomassie.
• Solución decolorante: metanol y ácido acético.
• Solución transparentizadora: metanol y ácido acético.
• En el informe suele aparecer el % de cada fracción respecto a la concentración total.
• Espectrofotómetro: se recortan las distintas franjas y se introducen en un tubo con un disolvente. Se mide la absorbancia de cada disolución.
• Densitometría: un fotómetro cuantifica el colorante fijado en cada una de las franjas y lo representa mediante un proteinograma.

Conceptos Clave en Química

El punto de equivalencia en una valoración o titulación es el momento en el que la cantidad de sustancia valorante añadida es estequiométricamente equivalente a la cantidad de la sustancia que queremos analizar presente en la disolución problema.

Las soluciones amortiguadoras, soluciones tampón o búfers son aquellas disoluciones que mantienen constante el pH cuando se añaden pequeñas cantidades de ácidos o bases.

La potenciometría es una técnica electroquímica que permite determinar la concentración de una especie electrolítica en una disolución mediante el uso de un electrodo de referencia, un electrodo indicador y un voltímetro.

El grado de disociación (α) se define como el cociente entre la sustancia disociada respecto de la cantidad inicial o total. Se suele expresar en porcentaje.