Electroforesis: Principios, Métodos y Aplicaciones en Biología Molecular

Electroforesis: Conceptos Fundamentales y Aplicaciones

La electroforesis es cualquier técnica por la cual las macromoléculas se separan unas de otras en gradientes de potencial eléctrico, basándose en diferencias en sus cargas netas, sin importar el medio de conducción.

Principios de la Electroforesis

• Movimiento de partículas: Las partículas se mueven según su carga en un campo eléctrico.
• Fraccionamiento: Permite el fraccionamiento de ácidos nucleicos y proteínas.
• Carga de ácidos nucleicos: Los ácidos nucleicos son ácidos debido al fosfato, lo que les confiere una carga negativa.

Fuerza y Movilidad Electroforética

• Fuerza (F): La fuerza ejercida sobre una partícula cargada en un campo eléctrico se describe por la fórmula: F = qE, donde F es la Fuerza, q es la Carga neta y E es el Campo eléctrico.
• Esta fuerza causará la aceleración de la partícula en un medio líquido hasta que se alcance una velocidad constante. A esta velocidad, las fuerzas friccionales son iguales y opuestas a la fuerza aplicada.
• Velocidad (v) y Movilidad (u):
  • v = qE/f (donde f es el coeficiente friccional)
  • u = v/E (u: Movilidad electroforética en cm²/volt·seg; v: Velocidad en cm/seg; E: Campo eléctrico en volts/cm)
• Dado que la movilidad es proporcional a la razón entre la carga neta y el coeficiente friccional, es posible utilizar la electroforesis para obtener información acerca de la carga relativa (para moléculas de la misma forma y tamaño) o del tamaño relativo (para moléculas de igual carga).

Tipos de Geles y Soportes en Electroforesis

Malla Molecular (Geles)

• Agarosa: Se forman poros según la concentración del gel. El medio se mezcla con tampón (todo lo que es electroforético debe estar en tampón). El gel actúa como una malla a través de la cual pasan las partículas a estudiar.
• Visualización de ADN: Para estudiar el ADN, debemos agregar bromuro de etidio para poder visualizarlo (es un intercalante).
• Indicador de Avance: El azul de bromofenol avanza hacia el polo positivo (+) sin interactuar con nada, indicando el avance de la reacción (es un indicador del frente iónico).
• Requisito para Comparación: Para comparar, los ácidos nucleicos deben ser lineales.
• Poliacrilamida (PAA): Al agregar Bisacrilamida, se produce una "celdilla" o poros más pequeños que los formados en la agarosa. En general, los geles verticales se utilizan para proteínas.
• Preparación de Muestras de Proteínas: La solución de proteínas se agrega cuando el gel está todo líquido. Las proteínas pueden tener o no carga neta; cada proteína tiene un pH donde adquiere carga neta. A pH 7, la mayoría de las proteínas tienen carga neta negativa (-).

Condiciones de Electroforesis

Las condiciones de electroforesis se eligen según el objetivo de la separación:

• Condición Neutra o Nativa: Las moléculas se mantienen en su estado original, conservando su estructura tridimensional y carga nativa.
• Condición Desnaturalizante: Se utiliza para identificar el tamaño de la molécula. Requiere la ruptura de enlaces disulfuro (con BMe, beta-mercaptoetanol) y la estabilización de la desnaturalización (con SDS, dodecil sulfato de sodio). Una vez desnaturalizadas, las moléculas adquieren una carga y forma casi uniformes, permitiendo la separación principalmente por tamaño.

Geles Especiales para Mezclas Complejas

Al introducir una mezcla, algunas moléculas pueden tener desventaja en cuanto al camino recorrido. Para ello, existen geles especiales:

1. Gel Separador: Ordena las moléculas según el tamaño de los poros; su pH es de aproximadamente 8.
2. Gel Espaciador: Sus poros son más grandes que los del separador; su pH es de aproximadamente 6 (similar al pI de la glicina).

• La glicina empuja a las proteínas a través del gel espaciador, concentrándolas antes de que entren al gel separador.
• El gel debe teñirse posteriormente para visualizar las proteínas (ej. tinción Coomassie, metales, fluoróforos, etc.).

Tipos Específicos de Electroforesis

Electroforesis Libre

Una amplia zona o banda de macromoléculas en solución se somete a un campo eléctrico y se mide el desplazamiento de la banda. Fenómenos de difusión causarán el ensanchamiento de la misma, limitando su resolución.

Electroforesis Zonal

Inicialmente se parte con una banda muy delgada de la macromolécula y se utiliza un soporte sólido embebido en un medio líquido. Los soportes comunes incluyen: papel, agarosa y acrilamida.

Electroforesis en Geles de Agarosa

• La migración de moléculas lineales de ADN de doble hebra a través del campo eléctrico es inversamente proporcional al logaritmo base 10 (Log10) del número de pares de bases (pb).
• Las moléculas más grandes migran más lentamente debido a una mayor fuerza friccional y lo hacen menos eficientemente a través de los poros del gel.
• La conformación del ADN es fundamental en la migración. El ADN circular superenrollado (forma I), el ADN circular relajado o cortado (forma II) y el ADN lineal (forma III) del mismo tamaño migran a diferentes velocidades.
• La velocidad de migración relativa depende principalmente de la concentración de agarosa en el gel, y también está influenciada por la intensidad de la corriente aplicada, la fuerza iónica del tampón y la densidad de superenrollamiento en la forma I del ADN.