Electroforesi i Cromatografia: Mètodes de Separació de Molècules

ELECTROFORESI: mètode per separar molècules per corrent elèctric en funció de la velocitat de migració (velocitat a la qual es desplacen). Aquesta depèn de la densitat de càrrega i d'altres paràmetres. Les molècules han d'estar carregades per desplaçar-se (positives al pol negatiu (càtode) i han de tenir la mateixa càrrega per a que vagin al pol contrari, separant-se entre elles per velocitat de migració.

FACTORS:

1. CÀRREGA NETA: són amfòters (àcid/base segons pH). A) pH = pI: càrrega neutra no migra. B) pH < pI: càrrega positiva comporta com a catiò que migra al càtode (pol negatiu). C) pH > pI: càrrega negativa comporta com a aniò que migra a l'ànode (pol positiu).
2. FORÇA IÒNICA DEL MEDI: quan més [c] més corrent transport. [C] també ha de ser suficient per mantenir constant el pH i proporcionar força iònica per al moviment de càrrega. Si hi ha més [c] requerida, la migració és més lenta i la separació és pitjor.
3. ESTRUCTURA I GRANDÀRIA.
4. POTENCIAL DEL CAMP ELÈCTRIC: la mobilitat electroforètica dels substrats és major quan més potencial elèctric. Augmentar el voltatge augmenta la temperatura: A) evaporació del tampó (augmenta [C] i força iònica, dificultant l'electrò), B) alteració de la mostra degut a la calor (desnaturació).

SUPORT: es diferencien per mida de partícules.

1. NO RESTRICTIU: es separen en funció de la càrrega elèctrica. A) paper (desús), B) acetat de cel·lulosa (gel màxim 5 bandes), C) gel d'agarosa (porus grans, diagnòstic clínic junt amb acetat, major resolució, absència de cromatogràfics, no reacciona amb la mostra i és transparent) (diagnòstic clínic, +7 bandes).
2. RESTRICTIU: resistència al desplaçament de proteïnes determinada per la grandària dels porus i les molècules (gel de mida petita utilitzat en investigació amb poliacrilamida).

POLIACRILAMIDA: les partícules migren però són frenades per la mida, amb un major nombre de bandes, gradients continus (la mida dels porus varia gradualment) i discontinu (zona diferenciada).

TAMPO: manté el pH constant, proteïnes sèriques 8.6-8.8, no ha d'alterar la molècula ni el suport. Veronal sòdic pH = 8.6, Tris-EDTA-Bòric pH = 8.8, Tris-Veronal pH = 8.72, Barbital sòdic pH = 8.6.

REVELAT: localització per tinció i rentat. LECTURA: elució (retalla i escull), densitometria (llegir la tira amb fotodensímetre).

ISOELECTROENFOCAMENT: separació per punt isoelèctric, separa amfòters, gran poder resolutiu, diferencia pI en 0.02. INMUNOELECTROFORESIS: agarosa (millor) o acetat de cel·lulosa, 2 fases: 1a separació de proteïnes o substàncies antígens, posterior difusió d'anticossos cap als antígens i d'aquests amb anticossos formant arcs de precipitació. MOSTRES D'ORINA: detecció de proteïna Bence Jones, diagnòstic de mieloma múltiple, càncer de sang, bandes beta-gamma. PROTEINOGRAMA: separa proteïnes en funció de la càrrega elèctrica, (+) albúmina - alfa1 globulina - alfa2 globulina - beta globulina - gamma globulina (-).

CROMATOGRAFIA: separació per diferència d'afinitat en dues fases. FASE: 1) mòbil: líquid-gas on es dissolen soluts, 2) estacionària: a través del flux de la fase mòbil. CLASSIFICACIÓ: 1) natural física: A) fase mòbil (líquid-gas), B) fase estacionària (sòlid-líquid), 2) forma física del sistema: A) cromatografia plana (suport pla), B) columna, 3) mecanisme físic d'adsorció: A) adsorció (pla/columna) (L/S) (G/S), B) repartiment (pla/columna) (L/L) (G/L), C) inter iònic (columna) (L/S), D) exclusió molecular (columna) (L/S), E) afinitat (columna) (estació conté unitat lligant, fase líquida mòbil).

ADSORCIÓ: atracció distinta per força/naturalesa entre substàncies i fase adsorvent, separació per grau de retenció. Canviem la polaritat de la fase mòbil per eluir substàncies retingudes, el grau d'atracció elabora una sèrie elutrópica. REPARTIMENT: separació de soluts per diferència de solubilitat en fase mòbil i estacionària immiscibles. (L/L) 2 mètodes: 1) fase normal: fase suport amb substància polar i fase mòbil apolar, equilibri de repartiment entre les dues fases, els compostos polars són més retinguts. 2) fase invertida: suport amb grup no polar i fase mòbil polar, soluts separats per caràcter relatiu no polar, els més polars són eluïts primer, +70% de separacions es fan en fase invertida. INTER IÒNIC: separació per diferència entre signe (+-) i magnitud de càrrega elèctrica. RESINA:

1. inter catiònic: càrrega de resina negativa, separa catiò; A) sulfonic.
2. inter aniònic: càrrega positiva, separa aniò. Intercanvia ions amb fase mòbil, aquells amb més força d'unió queden retinguts, canvi de pH o força per eluir, separa aminoàcids, proteïnes, hemoglobina.

EXCLUSIÓ MOLECULAR: separació per grandària molecular de substàncies, les de menor grandària queden retingudes pels porus, gel segons grandària molecular (sephadex), immunoglobulines, saber pes molecular, separa metabòlits de baix pes molecular. AFINITAT: separació per afinitat entre dos elements (enzim/substrat, hormona/receptor, anticòs/antigen).

PARÀMETRES:

1. coeficient de distribució: relació entre [c] molar del solut en fase estacionària i fase mòbil, és la distinta distribució del solut en les dues fases, el valor indica l'afinitat del solut per les distintes fases, quan més gran és, major és la proporció de solut retingut.
2. relació front del solvent: relació entre la distància des del punt d'aplicació i la distància des del punt d'aplicació fins al front del solvent, identifica substàncies per comparació amb patrons.
3. volum de retenció o elució: volum d'elució en el qual surt un compost d'interès, a major constant de distribució, major volum retingut.
4. temps de retenció: temps que tarda en eluir, el temps de referència és aquell que elueix substàncies no retingudes en fase estacionària, temps i volum de retenció serveixen per identificar substàncies.
5. selectivitat: factor que mesura la capacitat de separar soluts, es busca que sigui el més gran possible.
6. resolució: capacitat del sistema cromatogràfic per separar substàncies, valor de 1.25 o més per considerar-se bo.