Un ejemplo de ficha técnica de peluquería

3. Fundamentos, controles y aplicaciones de las técnicas de histoquímica enzimática (=histoenzimología)

3.1 ¿Qué son las técnicas de histoquímica enzimática?

- Técnicas para demostrar la presencia y actividad enzimática al reproducir la reacción que se daría in vivo (control T, pH, presencia de cofactores (precursor de conezimas), etc.) -> detecta enzimas

- La técnica se aplica in situ (= en corte histológico)

- Durante la fijación es importante conservar la actividad enzimática-> Recomendable trabajar con material congelado sin fijación química. Por ejemplo evitaremos el formol

- Se busca localizar donde se produce la reacción al observarla al microscopio al poner un producto que reacciona con la reacción del sustrato-
> se usan cromógenos que cambian las condiciones fisicoquímicas debido a la reacción, haciéndose visibles.

- Está quedando en desuso por el uso de inmunohistoquímica y técnicas de patología molecular

- El resultado de la técnica se verá:

– Opaco a la luz blanca, UV y haz de electrones

– En fluorescencia se verá luminiscente

3.2 Fundamento

- Hay diferentes técnicas de sustrato, pero la más frecuente es al técnica histoquímica de acoplamiento:

• Intervienen dos reacciones químicas simultáneas y acopladas:

  • 1ª. Reacción de transformación enzimática del sustrato

  • 2ª. Producción y precipitación del cromógeno

• Durante estas reacciones interviene 4 elementos muy importantes:

  • Sustrato

  • Producto primario de la reacción (PPR) -> es el resultado de la reacción de la enzima con el sustrato, actuando el PPR de acoplador de las dos reacciones químicas

  • Precursor no coloreado

  • Producto final de la reacción (PFR) -> compuesto coloreado que precipita

- Intervienen dos reacciones químicas simultáneas y acopladas:

• 1ª. Reacción de transformación enzimática del sustrato

  • La reacción de la enzima con el sustrato da el Producto primario de la reacción (PPR) que actúa de acoplador entre la primera y segunda reacción

• 2ª. Producción y precipitación del cromógeno

  • Uso del precursor no coloreado -> suele ser una sal de diazonio

» Sal diazonio + PPR = compuesto azoico (-N=N-) coloreado (PFR)

3.3Detección de enzimas

• Las siguientes técnicas sirven para detectar diferentes enzimas

3.4 fosfatasa alcalina

- Enzima que aumenta en enfermedades óseas, (neoplasias y fracturas) y hepáticas (por ejemplo obstrucción biliar)

- Hidrolizan enlaces éster

- Con esta prueba se busca ver donde está activa la enzima

3.5 NADPH-diaforasa

- NADPH-diaforasa es el nombre genérico de cualquier enzima capaz de llevar electrones entre el NADPH o NADH a un aceptor, como la sal de tetrazolio, a través de una enzima, como la óxido nítrico-sintasa

- Técnica que muestra moléculas deshidrogenasa como NADH, NADPH, etc.

- Se reduce a través del NADPH una sal de tetrazoilo a una sal coloreada (formazán)

- Técnica usada habitualmente en tejido nervioso para detectar la enzima oxido nítrico sintasa

3.6 ATPasas

- Usada en la determinación de miopatías

- Según su concentración permite determinar el tipo de fibra muscular (I o II)

- Se realiza con incubaciones a diferente pH

• Medio ácido inhibe ATPasa en miosina de fibra rápida

• Medio básico inhibe ATPasa de fibras lentas

- La técnica se basa en incubar el tejido con ATPasa e iones Ca+ con sales de cobalto al que se le añade el sustrato (ATP)

- La sal de cobalto pasa a fosfato de cobalto visible en MO

- El proceso se repite a diferentes pH

5. Histoquímica de las lectinas y aplicaciones

5.1 ¿Qué son las lectinas?

• Las lectinas son proteínas o glucoproteínas no inmunes que se unen a determinados azúcares

• Uníón específica a un carbohidrato en concreto al que presentan afinidad

• Puede utilizarse conjuntamente con inmunohistoquímica para tener color

• También utilizadas en otras técnicas como ELISA, western blot (electroforesis + inmuno) y cromatografía de afinidad de flujo

5.2 Aplicación de las lectinas

• Detección diferencial de oligosacáridos como en desarrollo, crecimiento, diferenciación, neoplasia, etc. -> usada como herramienta diagnóstica en anatomía patológica, ya que tejidos patológicos pueden mostrar azúcares diferentes al normal.

• Técnica útil en:

– La identificación de tumores por su alta especificidad, por ejemplo tumores gastrointestinales

– Reconocimiento de grupo sanguíneo al unirse a antígenos específicos

– Unidas a fluorocromos para cuantificar y separar poblaciones celulares a través de citometría de flujo. Ej leucemia

– Como trazador neuronal-> muestra las rutas neuronales

• Ventajas de las lectinas es su bajo precio y alta estabilidad

• Desventaja: reaccionan con azúcares terminales que están presentes en múltiples proteínas, pero no a una proteína en concreto. Por tanto ves la cantidad alterada pero no qué proteína específica -> inmunohistoquímica da información mucho más valiosa ya que detecta proteína específica

5.3 Detección

• La detección se hará mayoritariamente con tejidos congelados

• Las lectinas pueden conjugarse a moléculas fluorescentes, enzimas, anticuerpos, etc.

• La lectina estará marcada con moléculas fluorescentes o enzimas como la fosfatasa alcalina

– Luego se muestra la presencia de la enzima o directamente por la molécula fluorescente

• La técnica requerirá:

– Controles positivos: Exponer la lectina a tejidos con elevada concentración de oligosacáridos conocidos para confirmar la afinidad de la lectina

• Por ejemplo eritrocitos y endotelio ya que lectinas tienen afinidad por estas células

– Controles negativos: preincubar la lectina a un exceso de azúcar por la que tenga afinidad para que no tengan sitios libres y así demostrar que se unen de manera específica

• Lectinas más usadas:

– HPA tumores metastásicos y de mal pronóstico

– GSA-IB4, detecta acúmulo de glucolípidos patológicos

– UEA-I, detecta el endotelio vascular para mostrar daño endotelial, por ejemplo dermatomiositis (inflamación músculo y piel)

INMUNOHISTOQUÍMICA

Anticuerpo

• Ig =Ac =glucoproteínas sintetizadas por linfocito B

Antisueros

• Formados por plasma con anticuerpos, encontramos:

– Policlonales: Mezcla de Ig que responden a diferentes epítopos de un mismo antígeno. Obtenidos al inyectar Ag a un animal de una especie diferente → Se consigue Ig producidas por diferentes clones de linfocitos

– Monoclonales: Todos los Ac reaccionan al mismo epítopo porque provienen del mismo linfocito B. Se consiguen al fusionar células de linfocito B con mielomas, obteniendo hibridomas.

Técnicas IHQ

• Hay 2 métodos:

– Directo: El antisuero primario está marcado, siendo la reacción de un solo paso

– Indirecto: El antisuero primario no está marcado y es reconocido por un antisuero secundario, o terciario, marcado

• Problemas del método directo

– Se ha de marcar todos los Ac

– Proceso tedioso y caro

– El marcaje puede alterar la inmunoreactividad

• Ventajas del método indirecto:

– No alteración del antisuero primario → conserva inmunoreactividad

– Antisuero secundario específico a una Ig de una especie en concreto → detecta todos los Ac primario sin importar el Ag que reconozca

– Método más sensible

• Desventaja método indirecto:

– Requiere de controles, ya que cada capa puede aumentar la señal inespecífica si el antisuero secundario se une en algún lugar que no debe

Tipos de moléculas para marcar anticuerpos

• Técnicas inmunoenzimáticas. Semejante a histoquímica enzimática

• Flurocromos → Microscopio de fluorescencia

• Oro coloidal, partículas densas a los electrones, útil en ME. También se usan en MO para precipitar sales de plata

Técnicas inmunoenzimáticas

• Usa el mismo principio que las técnicas de histoquímica enzimática

• Enzimas más utilizadas como marcadores:

– Peroxidasa

– Fosfatasa alcalina

• Se revelan usando el sustrato y cromógenos adecuados, dando productos insolubles de color marrón-negro, azul o rojo

• Enzimas endógenas iguales que el marcador tienen que ser inhibidas

Método general en inmunoenzimáticas

1. Hidratación del tejido en solución acuosa tamponada

2. Inhibición de enzimas endógenas

3. Inhibición de lugares de uníón inespecífico con suero normal de una especie diferente al antisuero primario, suele ser la misma que el secundario

4. Incubar el tejido con antisuero primario

5. Lavar → elimina Ig no unidas

6. Incubación del antisuero secundario

7. Lavar → elimina Ig no unidas

8. Revelar → incubar muestra con sustrato y cromógeno

9. Tinción de contraste

10. Montaje

Técnica inmunoenzimática: peroxidasa

• Inhibir peroxidasa endógena al poner una solución diluida del sustrato (H2O2 )

• Incubación de la peroxidasa (no endógena) con H2O2 + sustancia cromógena donadora de electrones (más habitual diaminobencidina (DAB))

• Por efecto de la peroxidasa H2O2 se reduce y el donador de electrones se oxida. • Esta reacción se mejora con anticuerpo anti-peroxidasa (PAP) que aumenta la sensibilidad

Técnica inmunoenzimática: fosfatasa alcalina (APAAP)

• Técnica útil en tejidos con pigmentos porque interfieren en resultado de peroxidasa

• Inhibición de la fosfatasa alcalina endógena (isoformas) con levamisol (excepto la intestinal)

• Técnica no recomendada en intestino

• Mismo método que la peroxidasa

Técnica de los complejos avidina-biotina (ABC)

• Técnica muy utilizada

• Avidina → glucoprot.// Biotina → Vit.

• La biotina se une covalentemente a la avidina e Ig.

• Técnica de tres pasos, se utiliza antisuero secundario biotinado

• Después del Ac secundario se añade complejos avidina-biotina-peroxidasa

• Da una señal muy amplificada porque el complejo ABC es grande

• Problema: avidina puede dar marcaje inespecífico debido a lectinas endógenas→ se evita usando estreptadivina, no está glucosilada

Inmunomarcaje múltiple

• Detección de más de un antígeno en una sola preparación

• Usa diferentes enzimas, fluorocromos u oro coloidal de diferente tamaño

• A través de técnica directa(1 Ac→1 color), pero baja sensibilidad

• Técnica indirecta → reacciones cruzadas (1º-2º/2º-2º) → solución, antisueros de especies distintas

¿Si no se puede utilizar antisueros primarios de diferentes especies?

• Ac primario de la misma especie → método secuencial, evitar reacciones cruzadas (2 opciones):

– Bloqueo inmunológico de grupos que pueden dar reacción cruzada bloqueando los lugares de uníón libres del antisuero primario o secundario, a través de:

• Suero normal de una determinada especie

• Fragmentos Fab (monovalentes) para Ig específicas de la especie utilizada

• Ac que reaccionan a antígenos no presentes en la muestra (pero sí con los que hemos añadido)

– Fragmentos Fab para “convertir” el Ac primario de una especie en otra, ej.

• Ac primario de ratón lo incubamos con Fab de cabra que reacciona al de ratón

• Ahora se muestra el de cabra, pudiendo usar Ac secundario marcado de conejo que reacciona al de cabra

• Luego aplicamos el Ac primario de ratón para el segundo antígeno y luego el secundario anti-ratón marcado

– Incubar previamente el Ac primario y secundario marcado y luego exponerlo a la muestra → peligro de reducir la inmunoreactividad (en desuso)

• En reacciones múltiples los controles son todavía más importantes para controlar reacciones cruzadas

Afectación de la inmunoreactividad

Fijación e inclusión

• Fijación afecta la antigenicidad al alterar las proteínas

– Preservar morfología → entrecruzantes

– Preservar antígeno → fijadores precipitantes (acetona o alcohol) / criostato

• Inclusión: elevada T puede disminuir antigenicidad, alternativas:

– Parafina de bajo punto de fusión

– Criostato

– Técnica de preembeding

• Corte 20-40 µm en vibratomo o criostato

• Aplica técnica

• Realizar la inclusión

– Generalmente se usan métodos postinclusión

Desenmascarar antígenos

• Mostrar antígenos “escondidos” debido al proceso de fijación/inclusión

• Esto se llama recuperación antigénica

• Se aplica a muestra fijadas con aldehídos (puentes hidroximetileno) → Formol

• Se desconoce el mecanismo de acción de las técnicas usadas

• 2 métodos para desenmascarar el antígeno:

– Digestión enzimática (recuperación antigénica mediante proteólisis)

• Incubar corte (37ºC) con enzima proteolítica

• Puede destruir algunos epítopos y afectar morfología tisular

– Calor → calienta los cortes hidratados en solución acuosa a pH determinado durante un tiempo variable. Soluciones más utilizadas

• Citrato a pH 6, Tris-EDTA pH9, Tris-HCl a pH 10

– Pueden usarse a diferente pH y con detergente

• Realizado en microondas, olla a presión, autoclave, baño María. Aparatos de laboratorio dan mejor control

Controles

• Garantizar la especificidad

• Evitar falsos positivos

– Asegurar que no hay autofluorescencia o pigmentos.

• Especificidad de los resultados depende de:

– Especificidad antisuero primario

– Especificidad de la técnica inmunohistoquímica

Antisuero primario

• Causas de tinción inespecífica:

– Alta heterogeneidad de las Ig en antisuero policlonal

• Reacción cruzada con antígenos con epítopos parecidos

– Lo evitaremos incubando el antisuero con antígenos que dan reacción cruzada

– Reacción de Ig con molécula transportadora (carrier)

• Usar molécula transportadora que no este de forma natural en el tejido a estudiar

– Uníón inespecífica por interacción electroestática, hidrófobas o receptores de la fracción Fc de la Ig en el tejido

• Uso de suero no inmune y de especie distinta para que ocupe los lugares inespecíficos

• Añadir detergente a baja concentración después de incubar (lavado), ya que las uniones inespecíficas son más débiles que Ag-Ac

– Presencia de Ig endógenas reconocidas por antisuero secundario

• Bloquear Ig endógenas antes de la incubación

Control positivo

• Utilizar muestra que ya sabemos que presenta el mismo antígeno y ha sido procesada igual

• Utilizar un control positivo para cada antisuero primario utilizado

• Realizar la preparación control y la de interés en paralelo

• Si el control positivo no da resultado → error durante el procedimiento → resultado inválido

Control negativo

• Realiza la técnica omitiendo algún paso

– Realizar el revelado sin pasos previos → se mostrará la presencia endógena

– Cambiar el antisuero primario por suero no inmune de la misma especie (si es monoclonal es de la misma especie pero que no reconozca el antígeno) y del mismo isotipo, ej IgA

– No poner antisuero secundario o complejos, ej ABC.