Duplicació DNA

Los Ácidos Nucléicos son macromoléculas de la materia viva y una de las más estudiadas, al ser los responsables de las funciones biológicas en los seres vivos. Están localizados principalmente en el núcleo de la célula pero también se encuentran en el Citoplasma y otro orgánulos como: Mitocondrias, Ribosomas y Cloroplastos. Son polímeros de nucleótidos unidos por un enlace fosfodiester, entre el fosfato del C5’ de un nucleótido y el grupo hidroxilo(-OH) del C3’ de otro nucleótido. Están constituidos por C, H, O, N y P y en los seres vivos encontramos 2 tipos:

Ácido Desoxirribonucléico (ADN)

, que almacena la información genética y transmite la información genética de generación en generación.

Ácido Ribonucléico (ARN)

, encargado de expresar la información genética, ejecuta las ordenes del ADN y permite la síntesis de proteínas. 

El ADN:

Es un polímero de nucleótidos de A, G, C y T unidos por enlaces fosfodiester dando como resultado largas cadenas con un extremo 5’ fosfato libre y un extremo 3’ gr.Hidroxilo libre. Su lectura se realiza en dirección 3’-5’ y su síntesis en dirección 5’-3’. Se localiza en el núcleo unido a unas proteínas llamadas Histonas pero también en mitocondrias y cloroplastos en caso de células eucariotas; para las células procariotas forma un nucleoide, el cual no tiene envoltura nuclear y ocupa la mayor parte del citoplasma. Watson y Crick establecieron el modelo de doble hélice gracias al estudio por difracción de rayos X de fibras de ADN. Esta formado por 2 cadenas antiparalelas unidas por P.De H entre las bases, en su estructura tridimensional encontramos varios niveles:

Estructura Primaria:

secuencia de nucleótidos de una sola cadena o hebra, con 2 extremos libres uno 5’ y otro 3’, en dirección 5’è3’. La secuencia de bases combinada en un orden constituye un GEN que contiene la información para la síntesis ordenada de aminoácidos que formaran una proteína. Estructura Secundaria: disposición en el espacio de las dos cadenas en Doble Hélice levógira o dextrógira según el tipo de ADN, siendo complementarias y unidas por Puentes de Hidrógeno entre sus bases además de ser antiparalelas.

Estructura Terciaria:

disposición que adopta la fibra de ADN al asociarse con las proteínas, enrollándose sobre si misma. En las eucariotas el ADN se une a las histonas formándose el nucleosoma . Al conjunto de estos nucleosomas se le llama Fibra de Cromatina.

Estructura Cuaternaria:

la fibra de cromatina, se empaqueta aún más adoptando una estructura de Solenoide Cuando la célula entra en división se puede empaquetar aún más formando los Cromosomas. 

REGLAS DE CHARGAFF

1. La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). A = T. La relación entre Adenina y Timina es igual a la unidad (A/T = 1). 2. La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). G= C. La relación entre Guanina y Citosina es igual a la unidad (G/C=1). 3. La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidínicas (T+C). (A+G) = (T + C). La relación entre (A+G) y (T+C) es igual a la unidad (A+G)/(T+C)=1. 4. Sin embargo, la proporción entre (A+T) y (G+C) es carácterística de cada organismo, pudiendo tomar, por tanto, diferentes valores según la especie estudiada. Este resultado indicaba que los ácidos nucleicos no eran la repetición monótona de un tetranucleótido. Existía variabilidad en la composición de bases nitrogenadas.

LA REPLICACIÓN:

Es un proceso, en el cual, a partir de 1 molécula de ADN se sintetizan 2 nuevas moléculas de ADN hijas con igual secuencia de nucleótidos que el ADN original. La síntesis de las nuevas cadenas se realiza en sentidos opuestos por acción de la ADN-polimerasa que añade nucleótidos a un ARN-cebador en dirección 5’è3’ por lo que la cadena molde se leerá en dirección 3’è5’. Podemos decir que la síntesis es antiparalela y semiconservativa, donde se sintetiza una cadena adelantada en el sentido de la apertura de la horquilla de replicación y la otra cadena sintetiza una cadena retrasada compuesta de fragmentos de Okazaki. 

LA TRANSCRIPCIÓN

Proceso que se realiza en el núcleo por el cual una secuencia de ADN de un gen se copia para dar una molécula de ARN, llamada ARNm. La enzima que interviene es la ARN-polimerasa que se une a la cadena molde de ADN al reconocer una regíón promotora=TATA o CAAT (próxima a un gen) en dirección 5’è3’. Una vez sintetizado el ARNm esté sufrirá una serie de procesos para garantizar su estabilidad:

Agregación de la CAP:

se añade al inicio del ARNm, en el extremo 5’ “una caperuza” que es una Guanina metilada evitando así su degradación por las ARNasas.

Poliadenilación:

por acción de una PoliA-polimerasa se añaden en el extremo 3’ una secuencia de entre 50-200 nucleótidos, una Cola de Poli-A. Esto facilita el que sea reconocido por el Ribosoma y también lo estabiliza.

Splicing:

el ARN que se forma esta constituido por Exones=parte codificante, el GEN y por Intrones=parte no codificante, que serán eliminados. Este ARNm que se sintetiza en el núcleo antes de sufrir estas transformaciones es un ARN inmaduro que para salir al citoplasma sufrirá estos 3 procesos transformándolo en ARNm maduro, el cual saldrá por los poros nucleares hacia el citoplasma.

EL ARN: El ácido Ribonucléico está formado por nucleótidos de ribosa con bases nitrogenadas que son: A, G, C y U (Aquí el Uracilo sustituye a la Timina), unidos estos nucleótidos por enlaces fosfodiester en dirección 5’è3’. Este ARN es monocatenario. Su función primordial es utilizar la información del ADN para realizar la síntesis de proteínas. El ARN presenta 2 niveles de estructuras: I.

Estructura Primaria:

se corresponde con la secuencia de las bases nitrogenadas, es la propia cadena de ARN.

Estructura Secundaria:

se corresponde con regiones de bases apareadas. Esta estructura aparece en el ARNt (ARN-transferente), en el cual quedan libres los extremos 5’(inicio) y 3’(final). TIPOS DE ARN:

ARN nuclear:

se encuentra en el nucléolo y constituye la regíón organizadora nuclear, se forma del ADN.

ARN ribosómico:

es el más abundante y constituye los ribosomas. Se expresa como Coeficiente de sedimentación de Svedberg(s); en Eucariotas es de 80S formado por una de 40S y otra de 60S mientras que en Procariotas es de 70S formado por una de 30S y otra de 50S.

ARN mensajero:

es lineal y monocatenario, su tamaño depende del tamaño de la proteína a traducir. Su información esta agrupada en Tripletes o Codones y cada uno determina la uníón de un aminoácido determinado. Es distinto en procariotas que en eucariotas.

ARN de transferencia

Transporta los aminoácidos a los ribosomas según la secuencia del ARNm, se encuentra disperso en el citoplasma. Su estructura es parecida a un trébol de 3 hojas, estructura secundaria. Con 2 extremos, el 5’ siempre con una G y un P libre y el 3’ siempre con CCA y un – OH al que se unirá el aminoácido.  

LA TRADUCCIÓN

Es un proceso por el cual se transforma la información de secuencias de nucleótidos de ARNm en secuencias de aminoácidos, es la Síntesis de las Proteínas. Ocurre en el citoplasma e intervienen los ribosomas (ARNr + proteínas) y el ARNt que contiene a los aminoácidos. Las reglas de correspondencia entre codones y aminoácidos es el Código Genético, se aparea el codón del ARNm con el anticodón del ARNt. Este proceso esta formado por 3 etapas:

Iniciación:

uníón del ribosoma al ARNm este proceso no comenzará hasta que se localice la señal de iniciación el codón AUG que se corresponde con la fenil-Met para procariotas y Met para eucariotas.

Elongación:

el ribosoma se desplaza por el ARNm leyendo de 3 en 3 los nucleótidos, en codones, en dirección 5’è3’.

Terminación:

cuando el ribosoma llega a algún codón de terminación, UAA, UAG o UGA (no hay ARNt con anticodón complementario). 

PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS Los polinucleótidos de DNA y RNA son hidrófilos debido a que se pueden formar puentes de hidrógeno entre el agua y los fosfatos, o el agua y los OH de la pentosa. Por tanto, son más solubles que las bases que los forman. A pH fisiológico, los grupos fosfato presentan dos cargas negativas (el pK más alto es 6), por lo que los polinucleótidos son de naturaleza ácida. Debido a que los polinucleótidos son moléculas muy largas en relación con su diámetro, proporcionan soluciones viscosas. Químicamente son muy estables, especialmente en el caso del DNA por carecer del 2’-OH. DESNATURALIZACIÓN La proporción A+T/C+G está relacionada en primer lugar con la estabilidad de la molécula de ADN de doble hélice. Desnaturalización o Fusión del ADN. Cuanto mayor es el contenido en G+C mayor cantidad de calor que hay que suministrar a un ADN de doble hélice para desnaturalizarlo. La temperatura de fusión (Tm) es la necesaria para desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla, esta directamente relacionada con el contenido en G+C, a mayor contenido en G+C mayor temperatura de fusión (Tm). RENATURALIZACIÓN: CURVAS CoT Velocidad de renaturalización: la velocidad de renaturalización del ADN de un organismo está relacionada con su complejidad. La complejidad se define como la suma del número de nucleótidos que tiene cada tipo de secuencia sin tener en cuenta el número de veces que esta repetida. Los organismos más complejos, como los eucariontes, presentan distintos tipos de secuencias en su genoma: Secuencias Únicas (SU), Secuencias de Bajo Número de Copias (SBNC, 2-10 copias), Secuencias Repetidas (SR, alrededor de 102 copias) y Altamente Repetidas (SAR, 103 a 106 copias). 

HIBRIDACIÓN

Las técnicas de desnaturalización y posterior renaturalización se utilizan para conseguir la hibridación de ácidos nucleicos, es decir, una vez separadas las dos hebras del ADN doble hélice, es posible volver a formar una doble hélice con una hebra de ADN que sea complementaria (hibridación de ADN con ADN) o volver a formar una doble hélice con un segmento de ARN que contenga la secuencia complementaria (hibridación de ADN con ARN). Las técnicas de hibridación (desnaturalización y posterior renaturalización) permiten, por ejemplo, identificar el gen que ha dado lugar a un determinado ARN-mensajero. Si se aísla un mensajero determinado en una célula, es posible hibridar este ARN con el ADN de la célula previamente fragmentado mediante el uso de endonucleasas de restricción. Las endonucleasas de restricción de tipo II son enzimas que reconocen secuencias cortas de ADN (de 4 a 6 pares de bases) de tipo palindrómico (es una secuencia de ácido nucléico de ADN o ARN que es lo mismo si se lee de 5’a 3' en una hebra o de 3' a 5' en la hebra complementaria) y cortan por el interior de la secuencia diana a la misma altura en las dos hélices de ADN (corte simétrico) o a distinto nivel en cada hélice (corte asimétrico).  Cuando el ADN de un organismo eucarionte se fragmenta con una endonucleasa de restricción, se producen cientos de miles o incluso hasta millones de fragmentos:
1.Dichos fragmentos se separan por tamaños mediante electroforesis en geles de agarosa. 2.Se transfieren los fragmentos a una membrana de nylon en condiciones desnaturalizantes y de forma que permanezcan en la misma posición. 3.Los fragmentos desnaturalizados y pegados a la membrana se pueden renaturalizar o hibridar utilizando un segmento de ADN o de ARN (habitualmente denominado sonda) marcado radiactivamente. Dicha sonda, hibridará solamente con aquellos fragmentos de ADN que contengan la secuencia complementaria:

La técnica que permite transferir los fragmentos de ADN desnaturalizados a una membrana de nylon y posteriormente hibridar con una sonda de ADN marcada se denomina Técnica Southern=hibridación ADN-ADN.

Cuando la hibridación se realiza con una sonda de ARN marcada se denomina Técnica Northern=hibridación ADN-ARN

Utilizando estas técnicas de hibridación "in situ" se puede localizar un segmento concreto de ADN, por ejemplo, un gen en una posición determinada de un cromosoma eucariótico. Actualmente el marcaje es por fluorescencia, denominada FISH. También se puede realizar para detectar un juego completo de cromosomas, si están presentes o no denominada GISH (hibridación “in situ” genómica). 

DENSIDAD

Existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del ADN determinada en un gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C mayor densidad posee el ADN. Estando esto también relacionado con el contenido en enlaces de Puentes de hidrógeno ya que las uniones entre A y T necesita 2 enlaces y las uniones entre G y C necesita 3. Para separar el ADN en base al gradiente de densidad: -EL ADN se mezcla con CsCl (Cloruro de Cesio) y es centrifugado a muy alta velocidad (p.Ej., 50.000 rpm) en una ultracentrífuga por muchas horas. Como los tubos giran, las fuerzas opuestas de sedimentación y difusión producen un gradiente lineal estable de CsCl con la más baja densidad arriba y la densidad más pesada en el fondo. Al formarse el gradiente de CsCl, el ADN se equilibra en el gradiente donde su densidad, densidad de flotación ρ, se iguala a la densidad del circundante CsCl.: -Si el ADN de una densidad está presente, el resultado será una sola banda de ADN. -Si dos ADN están presentes con densidades diferentes, el resultado será dos bandas de ADN. Establecíéndose así una fórmula empírica que relaciona la densidad de flotación (ρ) con el contenido en G+C expresado en moles por ciento. Está fórmula es la siguiente: ρ = 1,660 + 0,00098(G+C). 

Absorbancia a 260nm

 El estado físico de los ácidos nucleicos está relacionado con su capacidad de absorción de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 Å. El menor grado de absorción se produce en estado de doble hélice, la absorción aumenta cuando se produce la desnaturalización pasando a estado de hélice sencilla. Si degradamos este ADN de hélice sencilla a nivel de nucleótidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia. El aumento de la absorbancia recibe el nombre de Efecto Hipercrómico. Por tanto, la absorbancia a 260nm  se puede utilizar como una medida del estado físico de la molécula de ADN