Dominando la Bioquímica Proteica: Extracción, Purificación y Cuantificación

1. Extracción y Purificación de Proteínas

1.1 Ruptura Celular

Se realiza para liberar las proteínas contenidas en el interior de la célula. Los métodos empleados incluyen:

• Químicos: Detergentes, agentes quelantes (como EDTA), antibióticos y solventes orgánicos.
• Enzimáticos: Lisozima (para bacterias), lyticase (para levaduras) y diversas proteasas.
• Físicos: Congelación/descongelación, homogeneización, molienda, sonicación y choque osmótico.
• Prensa Francesa: Un método de alta presión eficaz para la ruptura celular.

1.2 Obtención del Extracto Proteico

• Se obtiene tras la ruptura celular.
• Las proteínas solubles se separan del resto de componentes celulares mediante centrifugación.
• Es crucial utilizar inhibidores de proteasas para prevenir la degradación de las proteínas durante este proceso.

1.3 Precipitación de Proteínas

Métodos basados en cambios de solubilidad inducidos por variaciones de pH, temperatura y fuerza iónica:

• Salting-in: Aumento de la solubilidad de las proteínas a bajas concentraciones de sal.
• Salting-out: Precipitación de proteínas a altas concentraciones de sal (ej. sulfato de amonio).
• Precipitación con solventes orgánicos.

1.4 Concentración de Proteínas

Para aumentar la concentración de las proteínas purificadas se emplean:

• Diálisis: Separación de moléculas pequeñas y sales mediante membranas semipermeables.
• Centrifugación diferencial y ultracentrifugación.

2. Cromatografía de Proteínas

2.1 Cromatografía en Capa Fina (TLC)

• Separación basada en el principio de adsorción.
• Fase estacionaria: Generalmente sílice o alúmina.
• Fase móvil: Un disolvente o una mezcla de disolventes.
• Se calcula el Factor de Retención (Rf), que indica la distancia relativa recorrida por la muestra en comparación con el disolvente:

  Rf = (distancia recorrida por la muestra) / (distancia recorrida por el disolvente)

2.2 Cromatografía de Intercambio Iónico

• Separa proteínas según su carga eléctrica neta.
• Fase estacionaria: Resinas con grupos cargados positivamente (intercambiadores aniónicos como DEAE) o negativamente (intercambiadores catiónicos como Dowex 50).
• Fase móvil: Una solución tampón con pH ajustado, cuya fuerza iónica se puede variar para la elución.

2.3 Cromatografía de Exclusión Molecular (Filtración en Gel)

• Separa proteínas según su tamaño molecular.
• Fase estacionaria: Un gel poroso (ej. Sephadex, agarosa, poliacrilamida).
• Elución:
  • Las moléculas grandes eluyen primero (Volumen Muerto, Vo), ya que no entran en los poros del gel.
  • Las moléculas pequeñas eluyen después (Volumen Total, Vt), ya que se difunden más en los poros.
  • El Volumen de Elución (Ve) se calcula como:

    Ve = Vo + Kd * Vp

    Donde Kd es el coeficiente de distribución, que indica cuánto se difunde la molécula en los poros, y Vp es el volumen de los poros.

2.4 Cromatografía de Afinidad

• Basada en la interacción específica y reversible entre una proteína y un ligando inmovilizado en la columna.
• Elución: Se logra cambiando la composición de la fase móvil (ej. alterando la fuerza iónica o añadiendo el ligando libre en solución para competir por la unión).

3. Métodos de Cuantificación de Proteínas

La determinación precisa de la concentración de proteínas es fundamental en bioquímica. Los métodos comunes incluyen:

1. Absorbancia a 280 nm: Basado en la absorción de luz ultravioleta por los residuos aromáticos (tirosina, triptófano) de las proteínas. Es rápido, pero su precisión puede ser limitada y depende de la composición de aminoácidos.
2. Método de Biuret: Se basa en la formación de un complejo púrpura entre los iones Cu²⁺ y los enlaces peptídicos en un medio alcalino. Presenta baja sensibilidad.
3. Método de Lowry: Implica la reducción del reactivo de Folin-Ciocalteu por los residuos de tirosina y triptófano, intensificando el color. Ofrece una sensibilidad media.
4. Método de Bradford: Utiliza el colorante Coomassie Blue G-250, que se une a las proteínas y cambia su absorbancia. Es sensible y rápido, aunque su respuesta puede variar según la composición de aminoácidos de la proteína.

4. Ejercicios Clave en Bioquímica Proteica

Para consolidar la comprensión de estos métodos, se recomienda practicar los siguientes ejercicios:

• Cálculo de la concentración de proteínas utilizando la ley de Lambert-Beer.
• Determinación del orden de elución de diferentes proteínas en cromatografías de exclusión molecular y de intercambio iónico.
• Selección y aplicación de los métodos adecuados para cuantificar proteínas según sus características y el contexto experimental.