DNA Transformazioa eta Manipulazioa Bioteknologian

Transformazioa: DNA Bakterio Zelulatan Sartzeko Prozesa

Transformazioa gertatzea oso zaila da, DNA molekulak eta mintzeko fosfolipidoek karga negatiboa dutelako. Horregatik, aurretratramendu bat egiten da, zelula transformaziorako egokiak bihurtuz, zelula konpetenteak.

Zelula Konpetenteak Lortzea

-Pareta zelularra partzialki degradatu. -Ioi positiboekin mintz plasmatikoaren karga neutralizatu errazago sartzeko.

Transformazioa Behartzea

-Elektroporazioa: Eremu elektriko batekin poroak ireki. Efizientzia handia, baina garestia. -Shock Termikoa: Tenperatura aldatuz denbora tarte txiki batean. Zelula konpetenteak eta ligazio nahastea izotzetan sartu 15-20 minutuz.

Nahasteari Elikagaia Gehitu

Ez du selektiboa izan behar, espresiorako eta erresistentzia garatzeko denbora behar duelako.

Transformazio Protokoloa

Behin transformazio protokoloa bukatuta, transformatuak izan diren bakterio zelulak hautatu. Transformanteak hautatu behar dira. Plasmidoak selekzio markadore bat izan; transformanteek aurrera, transformanteak ez direnak hil.

Transformanteak Isolatu

Transformanteak isolatu eta gero, errekonbinanteak direla baieztatu. Gure intereseko transformantea: ampizilina medio batean biziraun, tetraziklinarekiko ez erresistentea.

Bakteriofagoen DNA Sarraera Bakterioetan

Bi metodo nagusi: 1) Transfekzioa: Transformazioaren ekibalentea baina, plasmido bat erabili beharrean fago baten DNA erabili. Fagoaren DNA E. coli-ren zelula konpetenteekin nahasten da eta DNA errekonbinantearen sarrera “shock-termiko” bidez eragiten da. Oso efizientzia baxua du. 2) In Vitro Paketatzea: λ DNA molekula errekonbinanteak λ kapside eta beste osagai guztiekin paketatu ahal izatea saiodietan. Paketatze honek λ-ren genomak kodifikatutako proteina jakin batzuk behar ditu, zeintzuk kontzentrazio handietan presta daitezkeen λ partikula defizienteen kultibo zelularretatik. Askoz ere efizientzia altuagoa. Bi metodo nagusi: -λ zepa (andui) bakarrekoak eta λ bi zepa (andui) desberdinekoak.

Azterketa Automatizatuak

Mikroarray-ak: Hibridazio experimentu anizkoitzak egin ditzaketen miniaturizatutako gailuak. Geneen expresioa aztertzeko erabili. Ad: zelula berdin baten geneen expresio patroiak konparatzeko ingurugiroko bi baldintza desberdinetan. EZ du RNA sekuentziak lortzen, zunden erabileran oinarritu. Microarray batek milaka puntu, bakoitza gen batekiko espezifikoa den sekuentzia bati dagokiona. Luzera,has/buk,introien posiz, mutazioak dauden esan EZ. Gen batetik bestera dagoen espresio mailaren aldaketaren estimazio kuantitatiboa. Illumina Sequencing: 1) Laginaren prestaketa: tagmentazioa eta anplifikazioa. 2) Clusterra generatzea: Flowcell-ean, etiketen konplementarioak diren nukleotidoak. Helburua: norantza bakarrekoekin geratzea. Horretarako, lehenengo norantza batean eta gero bestean sekuentziatu: Bi norantzako sekuentziazioa. 3) Sekuentzioa: Cluster bakoitzean emititzen den fluoreszentzia jasotzeko ahalmena → Cluster bakoitzean irakurketa (read). Luzera,has/buk,introien posiz, mutazioak dauden esan BAI. Garestiago. Transkriptomak erabili. 4) Datuen analisia: Ensanblajea. Mugak: Read oso motzak. Abantailak: Akats oso gutxirekin eman.

DNA Erauzteko Pausu Orokorra

1) Laginketa: Kultiboa edo listuan. 2) Zelularen Lisia: DNA agerian gera dadin pareta zelularra eta mintz plasmatikoa hautsi behar da. Horretarako lisia eragingo duen disoluzioa erabili. 3) Proteinen Degradazioa: Zitoplasmako materialaren liseriketa eta DNA-ren proteinen degradazioa (nukleosomak). Horretarako proteasa K entzima erabili. 4) Osagaien Banaketa: DNA gainontzeko osagai zelularretatik banatu disolbatzaile organikoak erabiliz (fenol) eta zentrifugazio bidez. 5) DNA-ren Prezipitazioa: Etanola eta zentrifugazioa erabiliz. 6) RNA-ren Baztertzea: DNA-rekin batera prezipitatzen denez, RNAasa baten bidez baztertzen da. 7) Kontzentrazioa Eta Purifikazioa 8) Baieztapena Eta Kuantifikazioa: Elektroforesi bidez.

Gene Espezifiko Baten Klonajea

Klon Bat Genoteka Batean Identifikatzeko Metodoak: Hibridazio metodoak eta inmunodetekzioa.

Hibridazio Metodoak

Azido nukleikoen kate konplementarioak elkartu. 1) Interesa duen genearen sekuentziaren zati bat ezagutzen badugu, sekuentzia hori duen “sonda” markatua sor daiteke. 2) Klonen DNA desnaturalizatu eta mintz jakin batean fijatu eta isolatu. 3) Klon guztien DNA duen mintza, sonda markatuarekin batera nahastu eta inkubatu, hibridazioa gerta dadin. 4) Sonda markatuaren kontrako antigorputzak erabiliz, mintza errebelatu, sonda zein klonetan hibridatu den erakutsiz. 5) Mintza errebelatzea nagusiki radioaktibitatea edo kimioluminiszentzia bidez egiten da, sonda markatzeko erabili dugun metodoaren arabera.

Zunda: S eta N Blot-etan erabili. - Zunda erradiaktiboak: nick translation, end filling eta random priming. - Zunda ez-erradiaktiboak.

Inmunodetekzioa

Gen batetik eratorritako proteinaren inmunodetekzioan oinarritzen da. Proteina baten lagin purifikatu bat badugu, berau animalia batean injekta daiteke. Hiru egunen bueltan, animalia horrek gure proteinaren kontrako antigorputzak ekoiztuko ditu, zeintzuk erauzi daitezkeen. -Antigorputz primarioak gure interesako proteina expresatzen duen klona ezagutu eta lotu egiten da. -AG sekundario batek AG primarioa ezagutzen du. -Erreakzio entzimatikoa eman dadin behar diren konposatu guztiak gehitzen dira, erreakzio horrek argia edo kolorea sortzen duelarik. Hori da detektatzen dena.

DNA Manipulazioa

DNA Manipulaziorako Entzimak

Nukleasak: DNA hidrolizatu, nukleotido bat hurrengoarekin lotzen duen fosfodiester lotura degradatuz. ● Exonukleasak: DNAren muturretako nukleotidoen loturak degradatu. ● Endonukleasak: DNA kate barneko nukleotido arteko loturak degradatu. Errestrikzio endonukleasak: DNAren sekuentzia jakin bat ezagutu eta katea bertatik mozteko ahalmena dute. Bakoitzak errestrikzio leku ezberdina.

Ligasak: Fosfodiester loturak sortu. Ligazioaren efizientzia nahiko baxua da. Zeluletan sortzen diren kalteak eta etenak zuzentzeko funtzioa dute. Bioteknologian DNA molekula ezberdinak lotzen dituzte: ertz kamutsak eta ertz kohesiboak.

Polimerasa: DNA edo RNA molde batetik abiatuta, DNA kate berria sor dezaketen entzimak dira. DNA polimerasa eremu ezberdinez osatutako konplexu proteikoa da. Polimerasetan kontuan hartu behar: Efizientzia eta fidelitatea. Polim motak: DNA pol1, Taq polimerasa, alderantzizko transkriptasa. Alderantzizko transkriptasa: VIH-REN MEKANISMOA: 1) Infekzioa. 2) Fusioa. 3) Alderantzizko transkriptasak birusaren RNA molde harturik cDNA sintetizatzen du. Honek ez du proofreading aktibitate zuzentzailea. 4) Erribonukleasak RNA birikoa suntsitzen du. 5) Alderantzizko transkriptasak cDNA-ren kate konplementarioa osatzen du. 6) Proteina askoren bidez, cDNA nukleora sartzen da eta genoman integratzen da. 7) Zelulak berak birusarentzat beharrezkoak diren proteinak sintetizatzen ditu.

Aldakuntza Entzimak: Fosfatasa alkalinoa, polinukleotido kinasa eta deoxinukleotidil transferasa terminala.

Topoisomerasak: Biologikoki garrantzitsuak dira baina, oraindik ez dute aplikazio orokorrik bioteknologian. DNA zirkularraren enroilamentua kontrolatzen dute.