Diferencia entre depilación física y química
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EL MARCAJE DE LAS SONDAS
Las sondas empleadas en técnicas de hibridación deben estar marcadas para poder detectar el híbrido formado con la secuencia diana.
El marcaje pues es el procedimiento de marcar la sonda utilizada en las técnica de hibridación con la finalidad de poder visualizar los resultados.
El procedimiento para el marcaje de sondas dependerá del tipo de marcador que se utilice.
El tipo de marcador utilizado condiciona el método de detección del híbrido. Podemos clasificar los marcadores según que permitan o no la detección directa del híbrido.
Así tenemos:
Marcadores que posibilitan la detección directa del híbrido y dentro de estos encontramos los isótopos radiactivos y los fluorocromos.
Marcadores que requieren métodos indirectos de revelado en varios pasos. Haptenos.
Isótopos radiactivos.
Son elementos químicos con capacidad de emitir radiaciones. Los más utilizados son el fósforo 32 y el tritio.
Los isótopos radiactivos se utilizan principalmente en técnicas de hibridación en filtro como son southern blot, northern blot y dot blot.
La detección del híbridos ser realiza revelando el marcaje radiactivo mediante autorradiografía con una película de rayos X.
Fluorocromos.
Son compuestos químicos que emiten luz al ser excitados por la luz ultravioleta. Tradicionalmente se han utilizado derivados de la fluoresceína y rodamina.
Las sonda marcadas con fluorocromos se utilizan principalmente en la técnica fish (hibridación in situ fluorescente). El empleo de varias sondas marcadas con diferentes fluorocromos permite detectar simultáneamente varias secuencias diana.
Para la detección del híbrido marcado se requiere un microscopio de fluorescencia.
Haptenos.
son moléculas de pequeños tamaño que al igual que los fluorocromos se pueden acoplar a los nucleótidos y no alteran la especificidad de la sonda. Pero a diferencia de los fluorocromos no ùedén ser detectados directamente, con lo que la detección del híbridos requiere métodos indirectos de revelado basados en la afinidad química de moléculas o en métodos inmunológicos.
Los haptenos más utilizados son la digoxigenina y la biotina.