Diagnóstico de Enfermedades Virales: Técnicas, Sensibilidad y Especificidad en Salud Pública en Chile

Diagnóstico de enfermedades relacionadas con virus

Introducción a la sensibilidad y especificidad

Virus viable: si se inocula en una línea celular, es capaz de producir un efecto citopático.

• Las vacunas pueden producir efecto citopático (capacidad de infectar), pero no pueden producir enfermedad.
• Que el virus sea viable no tiene que ver con que produzca enfermedad, sino con que pueda estudiarse en una línea celular.

¿Qué se puede observar para saber si un paciente está infectado con un virus?

• Respuesta inmune: anticuerpos (respuesta inmune humoral) y respuesta inmune celular.
• Antígenos: glicoproteínas y proteínas de envoltura.
• Ácidos nucleicos.
• Virus funcional.
• Almacenamiento:
  • Refrigeración (4 °C)
  • Congelación (-20 °C y -80 °C)
  • Nitrógeno líquido (-195 °C): no produce daño a la bicapa lipídica del virus y permite mantenerlo por mucho tiempo.
• Los herpesvirus se conservan a 4 °C, porque el virus se destruye a temperaturas más bajas.

Las técnicas para identificar son útiles o no dependiendo de su sensibilidad y especificidad.

¿Qué podemos detectar de un virus?

• Antígenos
• Ácidos nucleicos
• Virus funcional
• Respuesta inmune (celular y humoral)

¿Qué aspectos son importantes a la hora de realizar un diagnóstico virológico?

• Bioseguridad (infraestructura).
• Técnica:
  • Rápida (método AC) o lenta (técnicas de microscopía).
• Especificidad y sensibilidad de la técnica. Diagnóstico rápido:
  • Diagnóstico específico
  • Respuesta anticuerpo
  • Antígeno viral
  • Ácidos nucleicos virales
• Costo/calidad.
• Efectividad de la técnica.

Técnicas directas e indirectas

Técnicas directas: cultivo celular (permite visualizar y estudiar el virus, observando el efecto citopático) y detección (antígenos, ácidos nucleicos, partículas virales).

Técnicas indirectas: serología (técnicas rápidas, detección de IgM e IgG).

Limitaciones de la PCR

• La PCR es muy sensible, por lo que puede dar falsos positivos. Indica que el DNA viral o bacteriano está presente, pero no que el paciente esté enfermo o infectado.
• La PCR no es una técnica de diagnóstico definitivo.
• Falso negativo: se produce por falta de especificidad.
• Falso positivo: se produce por exceso de sensibilidad.
• No existe ninguna técnica 100% fidedigna, por lo que deben complementarse las técnicas.

Diagnóstico rápido

• Antígeno viral:
  • Aglutinación: disminuye la sensibilidad y requiere alta cantidad de virus para poder analizar (ej.: rinovirus y adenovirus).
  • ELISA e inmunoblot: requieren altas cantidades de virus, ya que evalúan anticuerpos o partículas virales.
    • ELISA directo: detecta el antígeno viral o el virus propiamente tal.
    • ELISA indirecto: detecta anticuerpos contra esa partícula viral.
• Ácidos nucleicos:
  • Amplificación: amplificación de DNA/RNA y secuenciación.
  • Hibridación: sonda TaqMan (ILTV) e hibridación in situ (EBV).

Diagnóstico específico

Aislamiento viral:

• Cultivo celular
• Amplificación
• Contaminantes
• Bioseguridad

Sonda TaqMan: sonda, partícula de DNA que tiene secuencias específicas del DNA que se quiere amplificar, pero además está optimizada para aumentar la especificidad de la técnica.

La PCR convencional o TR debe confirmarse por secuenciación.

Del más rápido al más específico

1. Aglutinación
2. ELISA
3. Inmunoblot
4. Inmunofluorescencia
5. Amplificación DNA/RNA
6. Secuenciación
7. Hibridación
8. Microscopía electrónica
9. Aislamiento viral

• Para mejorar la especificidad se crearon las sondas TaqMan (diagnóstico específico de enfermedades); se unen a un área en particular que indica que se está analizando una secuencia específica.
• La PCR con sonda TaqMan (solo en tiempo real) casi no requiere secuenciación para confirmar, porque es altamente específica.
• ELISA: 0,25 horas (más rápido).
• Cultivo: 16-48 horas (más específico).
• Lo más utilizado es la serología.

Diagnóstico de enfermedades relacionadas con virus de importancia en salud pública en Chile

MINSAL

• Departamento de Epidemiología:
  • Enfermedades transmisibles de notificación obligatoria.
  • Enfermedades virales en el Boletín Epidemiológico trimestral: sarampión-rubéola, parotiditis, hantavirus, varicela.
  • Equipo de Respuesta Rápida (ERR): convocatoria; 7 de cada 10 están relacionadas con virus.
  • 2005: meningitis viral.
  • 2009: pandemia de influenza A (H1N1).
  • 2011-2012: hantavirus.
  • 2013: brote de influenza en Iquique.
  • 2013: brote de norovirus.
  • 2014: hantavirus.

Servicio Agrícola y Ganadero (SAG)

• Enfermedades virales en la situación sanitaria animal: enfermedad de Marek, influenza aviar, diarrea viral bovina, influenza equina, síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS), rabia.

Conceptos clave

• Brote: aparición repentina de una enfermedad debida a una infección en un lugar específico, limitada a un pueblo o a una pequeña área. Es la cantidad de casos que se va a detectar dentro de un lugar determinado.
• Epidemia: aumento en la cantidad de brotes, que son exageradamente excesivos con respecto a años anteriores.
• Pandemia: epidemia a nivel mundial; en muchos lugares del mundo existe la enfermedad al mismo tiempo y potencialmente podría matar a muchas personas.

Enfermedades virales de notificación obligatoria

Sarampión-rubéola

• Brotes en Chile debidos a la migración de personas antivacunas.
• Diagnóstico de notificación obligatoria basado en signos (exantema macular):
  1. Serología (ELISA indirecto IgM EIA)
  2. RT-PCR (RNA viral)
  3. Cultivo celular: líneas celulares Vero y HeLa (diagnóstico definitivo)

Parotiditis

1. Serología: ELISA indirecto IgM EIA.
2. Confirmación por RT-PCR (RNA viral).

Hantavirus

1. Serología IgM e IgG (ELISA indirecto).
2. RT-PCR (RNA viral): células blancas infectadas en sangre y tejidos.

Varicela

• Única vacuna viva atenuada contra enfermedad humana.
• Serología (detección de anticuerpos).
• PCR + genotipificación.

Meningitis viral

• Brotes esporádicos cada 3 o 6 años.
• Etiología desconocida: enterovirus (90%), vía fecal-oral.
• Diagnóstico: análisis de líquido cefalorraquídeo (PCR).
• ISP: cultivo viral para LCR, deposiciones e hisopado nasofaríngeo.

Influenza A (H1N1)

• Diagnóstico: PCR, ELISA de anticuerpos, secuenciación.

Hantavirus

• Diagnóstico: trombocitopenia + fiebre + radiografía de tórax con infiltrado. Serología, RT-PCR (aumenta la sensibilidad), inmunohistoquímica.
• Se dan posterior a incendios forestales, ya que el roedor elimina el virus por la orina y las secreciones.

Norovirus

• Coprocultivo.
  • Estudio viral, bacteriano y parasitario.
  • Rotavirus y adenovirus (es lo que se piensa).
• ISP: norovirus.
• La dosis infectiva es muy baja (20 partículas virales).