Diagnóstico de Enfermedades en Plantas: Técnicas de Muestreo, Postulados de Koch y Métodos de Detección

Toma de Muestras

1. Recoger plantas enteras siempre que sea posible. Es preferible cavar a arrancar.
2. Recoger más de una planta. Recoger plantas que muestren toda la gama de síntomas (especialmente iniciales), y también plantas sin síntomas.
3. Conservar las muestras lo más frescas posible: Utilizar bolsas de papel para el follaje y bolsas de plástico para las raíces. Asegurarse de que el suelo no contamine las muestras.
4. Recoger información importante:
   • Especie y variedad de la planta.
   • Edad de la planta.
   • Síntomas observados (tamaño de la planta, color, gravedad).
   • Distribución espacial de los síntomas.
   • Condiciones ambientales.
   • Tipo de suelo.
   • Manejo del cultivo (riego, abonado, tratamientos, etc.). Incluir información de fincas vecinas si es relevante.

Postulados de Koch

Los postulados de Koch son fundamentales para diagnosticar enfermedades en plantas:

1. El agente causal debe estar presente en todos los individuos (plantas) enfermos.
2. El agente causal debe aislarse de un individuo (planta) enfermo y cultivarse en un cultivo puro.
3. Cuando un cultivo puro del agente causal se inocula en un individuo sano susceptible, el huésped debe reproducir la enfermedad.
4. El mismo agente causal debe recobrarse otra vez del individuo inoculado e infectado experimentalmente.

Bioensayo

El bioensayo implica la inoculación en huéspedes determinados donde se producen síntomas característicos (plantas indicadoras). Este método detecta la presencia de un patógeno y comprueba los postulados de Koch.

Ventajas del Bioensayo

• Muy sensible.
• Puede ser muy específico: detección a nivel de raza.
• Detecta la presencia de complejos patogénicos.

Inconvenientes del Bioensayo

• La repetibilidad depende del huésped y las condiciones ambientales.
• Necesita invernaderos y plantas indicadoras, lo que puede ser caro.
• Puede ser muy lento.
• No siempre es fácil la inoculación.
• No es automatizable.

Métodos Químicos

Estos métodos implican una batería de pruebas bioquímicas que utilizan metabolitos primarios y la producción de metabolitos secundarios. La combinación de pruebas permite una identificación a nivel de género y, en algunos casos, a nivel de especie.

Limitaciones de los Métodos Químicos

• Poca especificidad.
• Fiabilidad de la identificación limitada.

Métodos Inmunológicos

Estos métodos se basan en la detección de epítopos por anticuerpos. Es necesaria una reacción específica entre el antígeno (patógeno) y el anticuerpo. Un ejemplo común es el ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).

Ventajas e Inconvenientes del ELISA

Ventajas

• Específico.
• Sensible.
• Relativamente rápido.
• Barato.
• Fácil de realizar.
• Repetible.
• Automatizable.
• Permite analizar varias muestras.
• Semicuantitativo.

Inconvenientes

• Especificidad a nivel de especie.
• Posibilidad de falsos negativos.
• Reacción cruzada que puede llevar a falsos positivos.
• Necesidad de anticuerpos específicos.

Métodos Moleculares

Estos métodos se basan en la detección de ácidos nucleicos, incluyendo la hibridación molecular y técnicas basadas en la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), como PCR, RT-PCR (Reverse Transcription PCR), Multiplex PCR, Inmuno captura PCR, PCR cuantitativa y PCR en tiempo real.

PCR: Método Molecular Detallado

La PCR es una amplificación in vitro de una secuencia de nucleótidos específica del organismo de interés. La especificidad está determinada por los cebadores o primers. La amplificación se realiza en un termociclador, utilizando una ADN polimerasa termoestable. El proceso consta de 30-40 ciclos de desnaturalización, hibridación y extensión. Los fragmentos amplificados se visualizan mediante electroforesis en gel de agarosa. Se emplea en la detección y análisis de secuencia, permitiendo la distinción entre cepas.

Ventajas de la PCR

• Muy específico.
• Muy sensible.
• Rápido.
• Reproducible.
• No muy caro.
• Automatizable.
• Permite analizar varias muestras.
• Permite detectar varios patógenos.

Inconvenientes de la PCR

• Necesidad de cebadores específicos.
• Requiere la puesta a punto de las condiciones de reacción.
• Necesidad de un termociclador.
• Requiere personal cualificado.