Determinación de Glucosa, Creatinina, Urea y Proteínas Totales: Métodos y Procedimientos

Determinación de Glucosa

Método GOD-PAD

Prueba enzimática colorimétrica por glucosa, método sin desproteinización.

Fundamento:

La glucosa se determina después de la oxidación enzimática en presencia de glucosa oxidasa. El peróxido de hidrógeno formado reacciona bajo la catálisis de peroxidasa con fenol y 4-aminofenazona, formando un complejo rojo-violeta usando la quinoneimina como indicador.

Principio:

Glucosa + O₂ + H₂O --GOD--> ac. glucónico + H₂O₂

2H₂O₂ + 4-aminofenazona + fenol ---POD--> quinoneimina + H₂O

Contenidos:

• RGT: buffer fosfato (pH 7,5), 4-aminofenazona, fenol, glucosa oxidasa, peroxidasa, mutarrotasa, estabilizantes.
• STD: glucosa

Estabilidad de los reactivos:

Son estables hasta la fecha de caducidad, aun después de abrir se almacenan a 2-8°C. Después de abiertos, evitar contaminación. RGT es estable por 2 semanas a 15-25°C.

Muestras:

Plasma, orina. La glucosa es estable hasta 24 horas a 2-8°C, si el suero o el plasma es separado dentro de 30 minutos después de la toma de muestra de sangre.

Ensayo:

• Longitud de onda: 500 nm, Hg 546 nm.
• Paso de luz: 1 cm.
• Temperatura: 20-25°C o 37°C.
• Medición: frente a un blanco de reactivo. Se requiere un blanco de reactivo por serie.

Esquema de pipeteo:

Mezclar, incubar por 10 minutos a 20-25°C o 5 minutos a 37°C. Medir la absorbancia del STD y las muestras frente a un blanco de reactivo antes de 60 minutos.

Linealidad:

Lineal para glucosa hasta 400 mg/dl. Si supera esta linealidad, diluir 1+2 con agua destilada y repetir la prueba. Multiplicar por 3.

Valores normales:

Suero o plasma (en ayunas): 75-115 mg/dl.

Control de calidad:

Humatrol y Serodos.

Notas:

Sueros ictéricos interfieren en la prueba y no pueden ser usados como muestras. Los triglicéridos hasta 2500 mg/dl, Hg hasta 500 mg/dl, ac. ascórbico hasta 50 mg/dl no interfieren en la prueba.

Creatinina

Reacción de Jaffé

Prueba fotométrica colorimétrica para mediciones cinéticas de creatinina, método sin desproteinización.

Fundamento:

La creatinina en solución alcalina forma un complejo coloreado rojo-naranja con ac. pícrico. La absorbancia es directamente proporcional a la concentración de creatinina en la muestra.

Principio:

Creatinina + ac. pícrico --> complejo creatinina-picrato.

Contenido:

• PIC, NaOH, STD.

Preparación del reactivo:

Diluir NaOH con agua destilada en proporción 1+4 en recipiente plástico. Para preparar el Reactivo de trabajo, mezclar PIC y NaOH diluido en proporción 1+1. STD listo para usar.

Estabilidad:

Los RGT y NaOH diluido son estables hasta la fecha de caducidad si se almacenan a 15-25°C. Se debe evitar contaminación. El reactivo de trabajo, protegido de la luz, permanece estable por 4 semanas a 15-25°C.

Muestra:

Suero, plasma heparinizado u orina. Evitar hemólisis. Estabilidad 24 horas a 2-8°C. Diluir la orina 1+49 con agua destilada.

Ensayo:

• Longitud de onda: Hg 492 nm (490-510 nm).
• Temperatura: 25°C.
• Medición: contra aire (aumento de absorción).

Atemperar los reactivos y las cubetas a 25°C. La temperatura debe permanecer constante (+/- 0,5°C) durante la prueba.

Esquema de pipeteo:

Mezcle e inicie el cronómetro. Leer a los 30 segundos (Abs. 1). Leer la absorbancia 2 exactamente a los 2 minutos después.

Linealidad:

Lineal en suero hasta 13 mg/dl, orina hasta 500 mg/dl. Diluir las muestras que sobrepasen la linealidad 1+5 con solución salina (0,9%) y repetir la prueba. Multiplicar por 6.

Valores de referencia:

Orina: 1000-1500 mg/24h.

Depuración de la creatinina: Hombres: 98-156 ml/min. Mujeres: 95-160 ml/min.

Control de calidad: Humatrol y Serodos.