Detección y Características de Leptospira y Bartonella: Microbiología Aplicada

Práctica Nº 26: Estudio e Identificación del Género Leptospira

Introducción

Las Leptospiras son microorganismos helicoidales, flexibles, con las espiras estrechamente unidas, muy móviles, con una longitud de 6 a 20 µm y 0.1 µm de diámetro, sus extremos semejan a ganchos semicirculares (ocasionalmente se presentan rectos).

El género Leptospira (Noguchi, 1917) pertenece a la Familia Leptospiraceae, Orden Spirochetales; comprende 6 especies patógenas: Leptospira interrogans con 18 variantes serológicas, L. noguchi, L. santarosai, L. borgpetersenii, L. weilii, L. kirhneri y L. inadai, y más de 200 serovares saprofitos comprendidos dentro de Leptospira biflexa. Se diferencian por su virulencia, sus propiedades antigénicas, reactividad frente a anticuerpos monoclonales, la prueba de la endonucleasa de restricción o la composición de su DNA.

La Leptospirosis es una zoonosis de distribución mundial. Los reservorios naturales son los roedores y una gran variedad de animales silvestres y domésticos, los cuales eliminan con la orina el agente etiológico, contaminando el agua, suelo, alimento, etc. El mecanismo de transmisión puede ser directo (orina, órganos de animales infectados) o indirecto (a través del agua o material contaminado). La puerta de ingreso al organismo humano es a través de lesiones de la piel y mucosas, incluyendo la conjuntiva ocular.

Se colorean por métodos especiales como Fontana Tribondeau (contiene nitrato de plata) y coloración de Kiktenko, ya que toman débilmente los colorantes de anilina. Son visibles al microscopio de campo oscuro en preparaciones frescas.

Desarrollan en medios especiales líquidos, semisólidos y sólidos enriquecidos con suero de conejo o carnero al 8-10%, a una temperatura óptima de 28 – 30ºC, en un periodo de incubación de 5- 10 días, en condiciones de aerobiosis.

Diagnóstico de Leptospirosis

Para el diagnóstico definitivo de Leptospirosis se requiere de:

1. Aislamiento de la Leptospira a partir de muestras clínicas (sangre, líquido cefalorraquídeo, orina) en medios de cultivo o inoculación en hámster o cobayo.
2. Evidencia serológica en sueros pareados con incremento cuádruple del título de diagnóstico inicial de 1:100.

Material

• Cultivo de Leptospira en medio semisólido de Fletcher modificado.
• Lámina control coloreada por el método de Kiktenko, Vago, Fontana Tribondeau, o Rojo de Congo.
• Microscopio.

Lectura

En el medio semisólido de Fletcher modificado, observar el desarrollo de las Leptospiras en todo el tubo y la formación de un anillo a unos milímetros de la superficie del medio.

En la coloración de Kiktenko, las Leptospiras se tiñen de un color rosado-violeta en fondo incoloro, presentándose sueltas o entrelazadas, semejando la letra C ó S, generalmente con los extremos en forma de semigancho y con las espiras bien unidas.

En la observación al microscopio de campo oscuro, las Leptospiras se observan como un “collar de perlas”, son muy móviles, realizan movimientos de traslación, rotación y alrededor de su eje.

Práctica Nº 27: Estudio e Identificación de Bartonella

Introducción

La familia Bartonelaceae comprende cinco (5) especies, siendo B. bacilliformes la causante de la Bartonelosis humana o Enfermedad de Carrión y se transmite a través de la picadura de un insecto alado hematófago conocido como Lutzomyia.

Bartonella bacilliformes presenta un marcado polimorfismo (bacilar, cocobacilar, cocoide), su tamaño varía entre 1- 3 µm de longitud por 0.25- 0.30 µm de diámetro, presenta flagelos unipolares en número de 1 a 10. En los cultivos jóvenes predominan las formas bacilares (forma virulenta), y en cultivo viejo la forma cocoide (no virulenta).

Se colorea escasamente con los colorantes de anilina (Gram negativas), pero sí tiene afinidad por los colorantes derivados de Romanowski (Giemsa, Leishman, Wright).

Desarrolla en aerobiosis y microaerobiosis, a una temperatura óptima de 29°C en medios enriquecidos con peptona, triptosa, y plasma (gel de fases) y medio bifásico con sangre y plasma, durante un periodo de incubación de 5- 10 días. Su crecimiento es lento, por lo general semanas, enturbia el medio con sedimento y a veces se observan películas o témpanos en la superficie de la parte líquida del medio.

Puede ser aislada de la sangre (hemocultivo) en la fase hemática de la enfermedad, de las lesiones eruptivas (fase verrucosa o histioide) y del LCR en los casos de neurobartonelosis.

Diagnóstico de Bartonelosis

En el laboratorio se puede aislar la bacteria por hemocultivo (fase hemática) usando el agar de fases, medio de aislamiento primario, por cultivo del verrucoma (fase eruptiva); se pueden realizar pruebas serológicas (aglutinaciones, fijación de complemento, Elisa, etc.), o por infección de los hematíes humanos por Bartonella (Danza de los hematíes) e inhibición del movimiento de los hematíes por acción de anticuerpos específicos antibartonella.

Material

• Frotis coloreados por Leishman, Wright o Giemsa procedentes de cultivo.
• Cultivo de la bacteria en Medio Agar Gel de Fases.
• Cortes histológicos de verrucoma coloreados con Hematoxilina-eosina.

Procedimiento e Interpretación

• Observar al microscopio las láminas coloreadas y apreciar la morfología y tinción de Bartonella. En las láminas coloreadas observar las bacterias en forma de empalizada y en forma aislada. En los cultivos observar la turbidez del medio, la formación de sedimento y la formación de películas o témpanos.
• Realizar esquemas de las observaciones realizadas.