Cultivos Microbianos: Optimización de Biomasa y Regulación Metabólica

Ejercicio 1: Análisis de Crecimiento en Cultivo Batch con Mezcla de Azúcares

En un cultivo batch en caldo que contiene una mezcla de azúcares fermentables, se midió un incremento lineal de 0.25 g/l/h de biomasa húmeda, el cual se mantuvo constante durante 2 horas. Luego de ese tiempo, el incremento de biomasa descendió al 12%, pero al cabo de 40 minutos el incremento alcanzó el 60%.

A. Explicación de los Resultados

Cuando están presentes dos fuentes de carbono, las levaduras pueden utilizar los sustratos en forma secuencial. Esto se puede deber a un crecimiento diaúxico, ya que primero se nota un incremento de biomasa, luego una fase lag, y finalmente un nuevo aumento.

• Glucosa: el principal azúcar fermentable.
• Al agotarse la glucosa: las células se desreprimen, se induce la síntesis de enzimas respiratorias y se inicia la degradación oxidativa de una segunda fuente de carbono (por ejemplo, maltosa en levaduras).
• Ocurre una segunda fase de crecimiento exponencial denominada diauxía.

La glucosa es utilizada más rápidamente y es la fuente de carbono preferida. La presencia de glucosa reprime el operón lac (en el caso de E. coli), permitiendo que la glucosa se utilice primero.

B. Cálculo de las Tasas de Crecimiento

• Fase inicial: 0.25 g/l/h
• Fase de descenso: 0.25 g/l/h * 0.12 = 0.03 g/l/h
• Fase de recuperación: 0.25 g/l/h * 0.60 = 0.15 g/l/h

Ejercicio 2: Regulación del Operón lac en E. coli

Explique el funcionamiento (regulación de la expresión) del operón lac de E. coli en las siguientes condiciones iniciales de cultivo:

A. Presencia de Glucosa

En este caso, el operón es regulado por la glucosa, es decir, hay represión catabólica. La presencia de glucosa reprime al operón lac. La concentración de AMP cíclico (AMPc) baja. El AMPc se une a la proteína CAP (proteína receptora de AMPc). Al estar unidos, se unen a su vez con el promotor para comenzar la síntesis de lac z, y a. Pero al haber baja concentración de AMPc por la alta concentración de glucosa, no se puede activar el operón. De esta manera, se ejerce un control positivo. La glucosa es utilizada más rápidamente que la lactosa y es la fuente de carbono preferida. La presencia de glucosa reprime el operón lac, permitiendo que la glucosa se utilice primero.

B. Presencia de Glucosa y Lactosa

Al haber presencia de lactosa, esta inactiva a la proteína reguladora lac, lo que bloquea la transcripción. Es decir, el operón queda libre para realizar el proceso de degradación de lactosa mediante el operón.

• Inductor: lactosa
• Ausencia de lactosa: represor activo, no hay expresión (off).
• Presencia de lactosa: inactivación del represor, hay expresión (on).

Ejercicio 3: Metabolitos Primarios y Secundarios

Establezca un cuadro comparativo entre metabolitos primarios y secundarios:

Ejercicio 4: Variación de Biomasa en Diferentes Tipos de Cultivo

Explique la variación de biomasa en el tiempo en un cultivo batch, por lote alimentado (fed-batch) y continuo.

• Batch: se agrega todo al comienzo y posteriormente se interviene para la salida del producto. Es un sistema poco modificado y el de peor obtención de biomasa.
• Fed-batch: es un sistema mejorado del batch porque se le agrega sustrato constantemente. De esta manera, la cantidad de biomasa aumenta considerablemente en comparación con el batch.
• Continuo: es el que tiene mejor producción de biomasa, ya que entra sustrato y sale producto constantemente. De esta manera, el cultivo está en fase log constante y siempre se genera biomasa.

Ejercicio 5: Desaparición de Células en un Quimiostato

¿En qué condición se puede producir la desaparición de las células del estanque en un cultivo en quimiostato? Explique.

Cuando la tasa de dilución es mayor a la tasa de crecimiento, el cultivo se lava. No alcanza a mantener células en el reactor, las que salen por el flujo de salida. En el quimiostato, en el steady state, el crecimiento celular se controla mediante el ajuste de la concentración (disponibilidad) de un sustrato limitante. Es un sistema abierto donde la tasa de ingreso es igual a la tasa de salida (volumen constante). Las células crecen exponencialmente por un periodo prolongado.

• Se selecciona una tasa de flujo para un determinado crecimiento steady state (tasa de crecimiento = tasa de dilución):
• Tasa de dilución > tasa de crecimiento: el cultivo se lava.
• Tasa de dilución < tasa de crecimiento: el cultivo sobrecrece.
• Tasa de dilución = tasa de crecimiento: cultivo steady state.

El producto es recolectado del flujo de salida. Los cultivos en quimiostato estables pueden operar continuamente por semanas o meses. La tasa de crecimiento en el steady state está fijada por la tasa de dilución (µ = D). De lo anterior se deduce que, dentro de ciertos límites, la tasa de dilución se puede usar para controlar la tasa de crecimiento del cultivo. En un cultivo de este tipo, el crecimiento de las células está controlado por la disponibilidad del componente químico limitante del crecimiento del medio, por esto el sistema es descrito como un quimiostato.

Ejercicio 6: Ventajas y Desventajas de Células o Enzimas Inmovilizadas

Señale y explique las ventajas y desventajas de un sistema de biotransformación o fermentación utilizando células o enzimas inmovilizadas.

Ventajas

• Mayor producción del metabolito deseado debido a una mayor concentración celular.
• Las células, al estar inmóviles, no se reproducen, por lo que toda la energía se gasta en la biotransformación del sustrato.
• Mayor durabilidad del cultivo (semanas o meses).
• Los cambios en el medio no afectan de sobremanera al cultivo. Se puede bajar el pH a 4.0 para evitar la reproducción de otros microorganismos, asegurando que no haya contaminación.

Desventajas

• Limitaciones en la aireación o presencia de O₂, ya que el cultivo, al estar encerrado en alginato de calcio (u otro material), no tiene acceso al oxígeno. Este sistema es adecuado para microorganismos anaerobios estrictos o facultativos.
• El tamaño del sustrato debe ser pequeño para poder ingresar hasta donde está el microorganismo. Un sustrato de alto peso molecular no puede ingresar por la pared de alginato de calcio.
• Puede haber problemas a la salida del producto.

Ejercicio 7: Efecto del Aumento de Sustrato Inicial en un Quimiostato

Esquematice y explique el efecto del aumento de sustrato inicial sobre la biomasa y concentración de sustrato residual en steady state en un quimiostato.

Al aumentar la concentración de sustrato inicial, el sustrato residual aumentará primero, ya que los microorganismos no podrán consumirlos todos. Pero a medida que pasa el tiempo, el consumo de los microorganismos se adaptará a esta nueva cantidad de sustrato, formándose así un nuevo steady state. Así, la concentración de biomasa en el steady state está determinada por las variables operacionales, S_R y D.

• Si S_R aumenta, x aumenta, pero s, la concentración de sustrato residual en el quimiostato, permanece igual.
• Si D aumenta, µ aumenta (µ = D) y el sustrato residual en el nuevo steady state debería aumentar para permitir la tasa de crecimiento aumentada. De este modo, menos sustrato estará disponible para ser convertido a biomasa, resultando en un valor de steady state más bajo. (Recuerden que al aumentar D, aumenta µ, pero x disminuye).

En un quimiostato, la concentración de sustrato limitante de salida es independiente de la concentración de sustrato limitante de entrada. A medida que S_R aumenta, también aumenta x, pero la concentración de sustrato residual no se afecta (pasado D_crit). También, D_crit aumenta levemente con el incremento de S_R.