Cultivo y Sensibilidad Microbiana: Técnicas y Aplicaciones Farmacéuticas

TP7: Anaerobios y Otros Requisitos de Crecimiento Microbiano

Clasificación de Microorganismos según su Requisito de Oxígeno:

• Anaerobios Obligados: Crecen solo en condiciones de alta densidad reductora. Incapaces de utilizar O2, el cual les resulta tóxico. Ej: Porphyromonas gingivalis (se encuentra en la boca, asociada a artritis reumatoide).
• Anaerobios Aerotolerantes: No mueren por exposición al O2. Ej: Propionibacterium acnes (en la piel, causa acné).
• Anaerobios Facultativos: Son capaces de crecer tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas. Ej: Staphylococcus aureus (causa endocarditis, meningitis), E. coli (biota intestinal de humanos, interviene en la absorción de nutrientes).
• Microaerófilos: Crecen mejor con bajas tensiones de O2 y son inhibidos por altas tensiones de O2. Ej: Streptococcaceae.
• Capnófilos: Requieren una tensión de CO2 aumentada antes que una tensión de O2 disminuida. Ej: Brucella, Campylobacter.
• Aerobios Estrictos (Aerotolerants): Crecen mejor en ausencia que en presencia de O2. Ej: Clostridium histolyticum.

Toxicidad del Oxígeno para Ciertos Microorganismos:

El oxígeno molecular (O2) es tóxico para algunos microorganismos debido a varias razones:

1. El O2 es un poderoso oxidante, es decir, un ávido receptor de electrones (e-). Por lo tanto, su presencia en solución es incompatible con potenciales redox bajos. Los anaerobios son gérmenes que se desarrollan bajo condiciones de potencial redox reducidos.
2. El O2 puede interactuar directamente con enzimas o cofactores, a través de la oxidación de grupos químicos sensibles (por ejemplo, sulfhidrilos), causando inactivaciones irreversibles.
3. El O2 produce sustancias tóxicas derivadas de su reducción parcial. Estos productos incluyen el radical superóxido, peróxido de hidrógeno (H2O2) y el radical hidroxilo.

Métodos y Procedimientos para el Cultivo Anaeróbico:

Incubación en Ausencia de Aire:

• Medios Líquidos (Hemocultivos): Contienen SPS (polianetol sulfonato de sodio), el cual estimula el desarrollo de los anaerobios, pero inhibe a Peptococcus anaerobius. Son frascos de 100 ml al vacío, con el agregado de CO2, una base nutritiva (digeridos trípticos de soja o peptonas), un agente reductor (tiol o tioglicolato). El porcentaje de sangre a inocular es del 5 al 10% v/v. Los frascos se observan diariamente buscando turbidez, hemólisis o gas. Se consideran negativos definitivamente a los 10 días de incubación, previo subcultivo final.

Jarras de Anaerobiosis (GasPak):

Se basan en:

1. Generación de H2 y CO2 mediante una reacción química cuyos sustratos se encuentran separados en un sobre al cual se le agrega agua, desencadenando la reacción.
2. La combinación del H2 y el O2 del aire para formar agua genera la anaerobiosis. Esta reacción es catalizada utilizando granallas de Zinc recubiertas de Paladio, las cuales se encuentran en una canastilla dentro de la jarra. Una tira de papel impregnada en Azul de metileno (azul en presencia de O2, incoloro en ausencia) introducida en la jarra es el indicador de anaerobiosis.

Sobres de Anaerobiosis (BioBag):

Consisten en una bolsa plástica transparente, gas impermeable, con una ampolla de indicador de anaerobiosis (resazurina) y una ampolla generadora de anaerobiosis. Se introducen uno o dos placas de Petri antes de sellar la bolsa mediante un sellador plástico por calor. Luego se rompen las ampollas de indicador y generador. Los gérmenes crecen y se mantienen viables por al menos una semana. Este sistema tiene las ventajas de su economía y practicidad.

El procedimiento crítico es el aislamiento de colonias, resultado de la agrupación de células bacterianas individuales. Se requiere una incubación más prolongada, usándose 2 o más días para el aislamiento general. La indicación de género y especie se hace como para los facultativos o aerobios, aunque dando mayor importancia a los productos de fermentación (Ej. Ácido láctico, Ácido succínico, Ácido propiónico, etc.).

Extracción de Oxígeno de Medios de Cultivo:

1. Calor: El O2 es menos soluble en agua caliente que en agua fría. Por ende, se colocan los tubos que contienen medios de cultivo en un baño de agua hirviente durante 15-20 minutos, y luego se ponen rápidamente en agua fría.
2. Sistema Gas Pak: Contienen polvos secos que, al mezclarse con agua, generan una atmósfera sin oxígeno. El borohidruro de Sodio (NaBH4), al reaccionar con agua, desprende H2, generando anaerobiosis. Se emplea un catalizador de Paladio a temperatura ambiente. Como fuente de dióxido de carbono, se usan tabletas de ácido cítrico o bicarbonato de Sodio. Indicador: Azul de metileno.

Siembra y Aislamiento:

1. Medios Líquidos: No es recomendable, excepto en el caso de los hemocultivos. Una de sus desventajas es que no es factible la determinación cuantitativa. Ej: Caldo Sangre para anaerobiosis, Caldo ICC (suplementado con extracto de levaduras), Caldo Thiol, Caldo Carne.
2. Medios Sólidos:
   • Agar Sangre para Anaerobios: El agar base puede ser Agar Brucella o Agar ICC, complementados con hemina y extracto de levadura. Se agrega sangre animal normal (5%), vitamina K1 (10 mg/L), extracto de levadura (0,5%) y cisteína (0,05%).
   • Placas idénticas, pero adicionando un aminoglucósido para inhibir el desarrollo de facultativos. Se puede utilizar también Agar MacConkey.

Pasos del Práctico (TP7):

1. Eliminar el oxígeno de los tubos de tioglicolato.
2. Sembrar en medio líquido y medio sólido (agar sangre y chocolate).
3. Incubar en condiciones de microaerofilia (lata con vela prendida, algodón humedecido, placas invertidas y tubos).

TP8: Antibióticos y Antibiograma

Antibióticos:

Los antibióticos forman un grupo heterogéneo de sustancias que interfieren en determinadas reacciones metabólicas de los microorganismos (m.o.), ocasionando la detención de su desarrollo o su muerte. Deben llegar en concentración suficiente al sitio de la infección, a través de difusión simple dependiente de un gradiente de concentración o por medio de transporte contra gradiente de concentración.

Mecanismos de Acción:

• Inhibición de la síntesis de la pared celular (Penicilinas).
• Alteración de la permeabilidad de la membrana celular (Polimixinas, Imidazoles).
• Inhibición de la síntesis de DNA (Quinolonas, Ácido nalidíxico, Ciprofloxacina).

Antibiograma:

Se utiliza para el conocimiento de la sensibilidad a los antibióticos (ATB) del m.o. causante de una enfermedad. No solo es importante para hacer la selección inicial del agente terapéutico, sino que además, en aquellos casos en los que el paciente presenta intolerancia a determinado fármaco, permite seleccionar el más adecuado para ese paciente en particular.

Se utiliza Agar Mueller-Hinton en las pruebas de sensibilidad de m.o. aerobios de rápido crecimiento. Cuando se trata de estreptococos u otros m.o. exigentes, se le añade al Mueller-Hinton un 5% de sangre desfibrinada, generalmente ovina. El más usado es el del disco de papel. La variante más utilizada de este método es la de Kirby Bauer.

Método de Kirby Bauer:

El m.o. es inoculado en la superficie de una placa de agar, sobre la cual se colocan discos impregnados con una concentración conocida del ATB. Las placas se incuban por 16-18 horas a 35-37°C. Durante la incubación, el ATB difunde radialmente desde el disco a través del agar, por lo que su concentración va disminuyendo a medida que se aleja del disco, hasta que la concentración del ATB en el medio es incapaz de inhibir al germen en estudio. El diámetro del área de inhibición alrededor del disco puede ser convertido a las categorías de sensible, intermedio o resistente.

Metodología del Antibiograma:

Preparación de Placas con Medio de Cultivo:

Debe utilizarse Agar Mueller-Hinton (pH de 7,2 a 7,4). Este agar presenta buena reproducibilidad de resultados lote a lote. Es pobre en contenido de timina (compite con las sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclinas, lo que daría falsas resistencias). Brinda buen crecimiento a varios patógenos. Se encuentran gran cantidad de datos sobre pruebas de sensibilidad con este medio. Deben verterse por placa de 25 a 30 ml de agar fundido para obtener una altura de 4 mm. Esto es importante para no tener halos muy reducidos o ampliados. Para evitar las gotas de condensación en la superficie del agar, secar las placas de 15 a 30 minutos invertidas en estufa a 37°C antes de la siembra.

Preparación del Inóculo:

Se toman 3 a 10 colonias bien aisladas con una asa y se introducen en 5 ml de caldo de triptona de soja. Se pretende obtener la turbidez del testigo (0,5 de la escala McFarland: 0,5 ml de BaCl2 0,048 M (1,175% p/v) + H2SO4 1 N (1% v/v)). En base a esta comparación, se determina si es necesario incubar a 37°C, diluir en Solución Fisiológica (SF), o directamente sembrar en Agar M-Hinton.

Siembras de Placa:

Se sumerge un hisopo estéril de algodón en el inóculo, oprimiendo el algodón contra las paredes del tubo para descartar el exceso de líquido. Se aplica el hisopo sobre la superficie del agar estriando uniformemente y rotando la placa cada 60 grados. Se seca unos 5 minutos antes de aplicar los discos.

Colocación de Discos:

Se realiza con una pinza estéril, haciendo una ligera presión. Luego de colocar los discos, se incuba en estufa a 37°C durante 16-18 horas.

Pasos del Práctico (TP8):

1. Placas con medio M-H.
2. Preparar suspensión del m.o. (bacilos negativos y cocos positivos), comparar turbidez según escala de McFarland 0,5 (10^8 de inóculo).
3. Sumergir el hisopo estéril en la suspensión.
4. Sembrar en la placa diseminando el inóculo.
5. Poner los discos.
6. Incubar: 16-18 horas a 35°C.
7. Analizar.

TP9: Control de Esterilidad en Medicamentos

El control de esterilidad en medicamentos se realiza para:

• Enumerar los m.o. presentes en la muestra y comparar con los límites de aceptabilidad establecidos.
• Inhibir el desarrollo de m.o. de prueba.
• Verificar la presencia de conservantes.

Actividad:

1. Apertura de los Recipientes: Limpiar bien las superficies exteriores de las ampollas y tapas de los viales y frascos con un agente descontaminante adecuado. Acceder al contenido de manera aséptica.
2. Preparación del Material de Ensayo:
   • Sólidos: Si no se disuelven completamente, reducirlos a polvo fino en mortero estéril.
   • Líquidos y dispersiones: Se toman directamente con una pipeta estéril o con aguja y jeringa estéril. Se transfiere asépticamente el volumen especificado del material desde su envase hasta un recipiente con el medio de cultivo adecuado. Se mezcla sin airear excesivamente.
3. Control de Esterilidad (Método: Transferencia Directa al Medio de Cultivo): Se toma 1 ml del producto farmacéutico y se inocula tanto en tubos con tioglicolato como en placas Petri. Luego se agregan 25 ml de los medios agarizados PCA (Plate Count Agar) y Sabouraud, y se realizan movimientos rotatorios correspondientes a la técnica de vertido en placa. Incubar 48 h a 37°C para bacterias y 5-7 días a 30°C para hongos.

Interpretación de Resultados:

• Sin desarrollo microbiano: Se sugiere realizar la prueba preliminar o control general.
• Con desarrollo microbiano:
  • Comparar con los límites microbiológicos establecidos por normativa vigente.
  • Si superan los límites de aceptabilidad microbiológica establecidos, se sugiere realizar las pruebas definitivas: ensayos para evidenciar la presencia de m.o. patógenos.

Ensayo Preliminar o Control General:

Se realiza para verificar la presencia de conservantes en la muestra. La ausencia de desarrollo microbiano en el control puede deberse a la actividad bacteriostática del producto en sí, o a la presencia de sustancias conservantes en el medicamento.

A) Ensayo Preliminar: Tomar asépticamente con pipeta despuntada 10 ml del producto farmacéutico de prueba y colocar en tubos de ensayo estériles. Inocular asépticamente 2 asas (10 UFC/ml) de cada uno de los m.o. de prueba: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans. Incubar durante 48 h a 37°C (bacterias) y 30°C (hongos).

B) Recuperación de los m.o. de prueba: Tomar 1 ml de caldo de cada tubo e inocular por duplicado en placas Petri. Luego agregar 25 ml de los medios agarizados PCA y Sabouraud y realizar movimientos rotatorios correspondientes a la técnica de vertido en placa. Incubar 48 h a 37°C (bacterias) y 30°C (hongos).

Interpretación del Ensayo Preliminar:

• Desarrollo de m.o. de prueba: Puede indicar que el producto farmacéutico: No tiene actividad bacteriostática. No tiene sustancias conservantes (se recomienda realizar las pruebas definitivas).
• Ausencia de desarrollo de m.o. de prueba: Puede atribuirse a que el producto farmacéutico: Posee actividad bacteriostática. Posee sustancias conservantes (se recomienda realizar la modificación de la técnica).

Modificación de la Técnica (Inactivación de Conservantes):

Esta prueba se realiza para inactivar el conservante en la muestra. Técnica de inactivación del conservante: Transferir asépticamente los ml del inactivante (Tween 80) que correspondieran al 4% del volumen de producto farmacéutico de prueba, agitar con cuidado, dejar actuar durante 30 minutos. Tomar 1 ml de la mezcla del producto farmacéutico y el inactivante e inocular en: tubos con tioglicolato y placas Petri. Luego verter 15 ml de medios agarizados Plate Count Agar y Sabouraud y agitar. Incubar de 2 a 7 días (bacterias a 37°C y hongos a 30°C).

Interpretación de la Técnica Modificada:

• Desarrollo microbiano en el producto farmacéutico: Inactivación del conservante y/o la presencia de contaminantes (enumerar los m.o. y cotejar con los límites de aceptación establecidos; se recomienda realizar pruebas definitivas).
• Ausencia de desarrollo microbiano: El inhibidor utilizado es el adecuado. No presenta contaminantes el producto farmacéutico de prueba.

4. Ensayos Definitivos:

Identificación de m.o. patógenos.

Conservantes:

Sustancias auxiliares que se agregan a las preparaciones oficiales para protegerlas de la contaminación microbiana. Ejemplos: ácido ascórbico, ácido isoascórbico (en cualquier concentración); Benzoato de Sodio, Fenol (con limitación de concentración).