Cromatografía: Técnicas, Aplicaciones y Análisis

Cromatografía: Fundamentos y Clasificación

La cromatografía es una técnica de separación que permite a los científicos separar componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas. Fue inventada en el siglo XX por el botánico ruso Mijaíl Tswett para separar pigmentos vegetales. El término proviene de las palabras griegas «chroma» (color) y «graphein» (escribir).

La separación cromatográfica se basa en la disolución de la muestra en una fase móvil (gas, líquido o fluido supercrítico) que se hace pasar a través de una fase estacionaria inmiscible. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido inmovilizado sobre un soporte sólido. Los componentes de la muestra se separan debido a las diferentes afinidades que tienen por la fase móvil y la fase estacionaria.

Clasificación de la Cromatografía

La cromatografía se puede clasificar de varias maneras:

Según la Disposición de la Fase Estacionaria

• Cromatografía Plana: La fase estacionaria se mantiene sobre una placa lisa y la fase móvil se desplaza a través de ella por gravedad o capilaridad. La fase móvil es siempre líquida.
• Cromatografía en Columna: La fase estacionaria se encuentra dentro de una columna. La fase móvil puede ser líquida o gaseosa.

Según el Tipo de Fase Móvil

• Cromatografía de Líquido: Utiliza una fase móvil líquida.
• Cromatografía de Gases: Utiliza una fase móvil gaseosa.
• Cromatografía de Fluido Supercrítico: Utiliza un fluido supercrítico como fase móvil.

Clasificación de Métodos Cromatográficos en Columna

• Cromatografía de Reparto: El soluto se equilibra entre el líquido de la fase móvil y el de la fase estacionaria debido a diferencias de solubilidades.
• Cromatografía de Adsorción: Las partículas de soluto son adsorbidas por la fase estacionaria.
• Cromatografía de Intercambio Iónico: Los iones de soluto son retenidos por los grupos funcionales de la fase estacionaria.
• Cromatografía de Exclusión Molecular: La separación se basa en el tamaño de las partículas.
• Cromatografía de Afinidad: Se basa en reacciones inmunológicas donde el soluto es un antígeno y los anticuerpos se encuentran adsorbidos en la fase estacionaria.

Cromatografía de Líquidos

La cromatografía de líquidos es una técnica analítica que se basa en la separación parcial o total de los componentes de una mezcla. La fase estacionaria más utilizada es la sílice modificada o microperlas de polímero. Las separaciones se logran por procesos de partición, adsorción o intercambio iónico.

Elementos de un Sistema de Cromatografía de Líquidos

• Sistema de Suministro de Fase Móvil: Fuerza el paso de la fase móvil a través de la columna. Las bombas de pistón son las más frecuentes y pueden trabajar en modo isocrático (composición constante) o gradiente (composición variable).
• Sistema de Inyección de Muestra: Se utilizan válvulas rotatorias de alta presión para introducir la muestra en la columna.
• Columna Cromatográfica: Tubos de acero que contienen el material de la fase estacionaria.
• Detectores: Dispositivos que detectan la presencia de los componentes separados. Los más comunes son los detectores espectrofotométricos, de fluorescencia, electroquímicos y refractométricos.

Tipos de Cromatografía de Líquidos

• Cromatografía de Partición: Utiliza una fase líquida retenida sobre un soporte sólido. Puede ser en fase normal o fase inversa.
• Cromatografía de Adsorción: Utiliza un relleno sólido como fase estacionaria, como sílice o alúmina.
• Cromatografía Iónica: Utiliza un cambiador de iones como fase estacionaria.
• Cromatografía de Exclusión por Tamaño: Utiliza geles permeables para separar especies de alto peso molecular.

Cromatografía de Gases

La cromatografía de gases es una técnica que utiliza una fase móvil gaseosa para separar los componentes de una muestra. Es especialmente útil para el análisis de compuestos orgánicos volátiles.

Componentes de un Cromatógrafo de Gases

• Suministro de Fase Móvil: Utiliza gases portadores como helio, argón, nitrógeno o hidrógeno.
• Sistema de Inyección de Muestra: Introduce la muestra en la columna de forma rápida, generalmente con una microjeringa.
• Columna Cromatográfica: Se encuentra en un horno termostatizado y puede ser de dos tipos: empaquetada o tubular abierta (capilar).
• Detector: Detecta la presencia de los solutos que salen de la columna. Los más comunes son el detector de ionización de llama (FID), el detector de conductividad térmica y el detector de captura electrónica.

Tipos de Cromatografía de Gases

• Cromatografía de Adsorción: La fase estacionaria es un sólido finamente dividido que retiene el soluto por adsorción.
• Cromatografía de Partición: La fase estacionaria es un líquido retenido por impregnación.

Parámetros Cromatográficos

Es importante considerar los siguientes parámetros en cromatografía:

• Tiempo de Retención: Tiempo que transcurre desde la inyección de la muestra hasta que el soluto alcanza el detector.
• Tiempo Muerto: Tiempo necesario para que una especie no retenida alcance el detector.
• Ancho del Pico en la Base: Tiempo transcurrido desde que el soluto alcanza el detector hasta que lo abandona.
• Factor de Reparto: Distancia recorrida por el soluto en relación a la fase móvil (en cromatografía plana).
• Constante de Distribución (Kc): Relación de la concentración del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria.
• Factor de Retención (K): Permite comparar la velocidad de migración de diferentes solutos.
• Factor de Selectividad: Relaciona los tiempos de retención de dos solutos.
• Resolución (R): Medida cuantitativa de la capacidad para separar dos compuestos.

Aplicaciones de la Cromatografía

La cromatografía tiene diversas aplicaciones en diferentes campos:

• Análisis Cuantitativo: Cuantificación de componentes utilizando patrones.
• Análisis Cualitativo: Identificación de componentes mediante el tiempo de retención.
• Análisis Farmacéutico: Análisis de principios activos, drogas, hormonas y esteroides.
• Análisis de Alimentos: Análisis de composición, vitaminas, azúcares, edulcorantes y colorantes.
• Análisis Ambiental: Análisis de pesticidas, disolventes organoclorados y gases inorgánicos.

Ensanchamiento de Banda

El ensanchamiento de banda aumenta a medida que el compuesto atraviesa la columna, debido a la dispersión que puede tener lugar con el tiempo.

Método del Estándar Interno

El método del estándar interno consiste en introducir una cantidad medida de una sustancia estándar en cada disolución y muestra para mejorar la precisión de la cuantificación.

Preparación de Muestras

La preparación de muestras es un paso crucial en la cromatografía. Algunas técnicas comunes incluyen:

• Extracción con Disolvente: Tratamiento de muestras sólidas con un disolvente para extraer selectivamente el analito.
• Extracción en Fase Sólida: Paso de la muestra (agua) a través de una columna con un material adsorbente.
• Cromatografía de Espacio de Cabeza: Determinación de constituyentes volátiles en muestras sólidas o líquidas analizando la fase de vapor.
• Técnica de Purga y Atrapamiento: Extracción de componentes volátiles de muestras líquidas usando un gas inerte de purga.

HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Resolución)

La HPLC es una técnica de cromatografía líquida que utiliza alta presión para mejorar la separación y resolución de los componentes de una mezcla. Los elementos principales de un sistema HPLC son: fase móvil, sistema de bombeo, inyectores, columnas, horno de columna y detectores.

Detectores en HPLC

Los detectores más comunes en HPLC son:

• Detector de Índice de Refracción: Útil para elución isocrática.
• Detector de Conductividad: Sensible a impurezas.
• Detector de Absorbancia UV: El más utilizado, con lámparas de deuterio, xenón o wolframio.
• Detector Electroquímico: Utiliza electrodos de referencia, auxiliares y de trabajo.

Elución en Gradiente

La elución en gradiente es una técnica que cambia continuamente la composición del disolvente durante la cromatografía para mejorar la separación de los componentes.

Cromatograma

Un cromatograma es una representación gráfica de la respuesta del detector en función del tiempo o volumen de efluente. El tiempo de retención es el tiempo transcurrido entre la inyección de la muestra y la aparición de la respuesta máxima.