Cromatografía Líquida de Reparto (L-L): Principios, Componentes y Optimización

1. Fundamentos de la Cromatografía Líquida de Reparto (L-L)

a) Fase Estacionaria (FE)

La fase estacionaria (FE) consiste en un soporte sólido con partículas microscópicas, recubierto por una película líquida inmiscible. La separación se basa en el equilibrio de los solutos entre las dos fases líquidas.

b) Modos de Trabajo

Fase Normal (NPLC)

En la fase normal, la fase estacionaria (FE) es más polar que la fase móvil (FM).

Fase Inversa (RPLC)

En la fase inversa, la fase estacionaria (FE) es menos polar que la fase móvil (FM). La fuerza eluyente de la FM es mayor cuanto más se asemeje a la FE. Se utiliza para eluir solutos polares que, de otro modo, estarían muy retenidos.

• Fase Estacionaria (FE): Generalmente hidrofóbicas (poco polares), como el octadecilsilano (C18).
• Fase Móvil (FM): Típicamente una disolución acuosa tamponada combinada con un disolvente orgánico (como acetonitrilo y/o metanol).
• Orden de Elución: En fase inversa, el orden de elución es de mayor a menor polaridad. Esto permite que casi cualquier compuesto pueda ser eluido.

Nota: La cromatografía líquida de fase normal (NPLC) es muy sensible a la presencia de agua en los disolventes.

2. Tipos de Cromatografía Líquida

a) Cromatografía en Lecho Abierto

1. Capa Fibrosa: La fase estacionaria (FE) se encuentra en una lámina de papel.
2. Capa de Partículas: La fase estacionaria (FE) es sílice.
3. Capa de Gel: La fase estacionaria (FE) es un gel de poliacrilamida.

b) Cromatografía en Columna

1. Columnas Clásicas o Convencionales de Relleno: La fase estacionaria se encuentra en una columna de acero.
2. Columnas Capilares: Utilizan un capilar flexible.
3. Columnas Monolíticas: Basadas en un monolito poroso.

3. Componentes de un Cromatógrafo Líquido

1. Módulo de Inyección: Generalmente automático. Dispone de una gradilla para viales y un recolector que los posiciona para la inyección mediante una aguja. Puede inyectar en columnas clásicas, microcolumnas y columnas capilares.
2. Bombas: Suministran la fase móvil a diversas presiones. Pueden operar en modo isocrático o gradiente, y son compatibles con diferentes diámetros de columna.

   Modo de Elución:

   • Isocrática: La fase móvil (FM) mantiene una composición constante durante todo el proceso.
   • Gradiente: La composición de la fase móvil (FM) varía durante el proceso.
3. Fase Móvil: Se almacena en recipientes específicos. Las bombas pueden ser isocráticas, cuaternarias o binarias, dependiendo de la complejidad de la mezcla de la fase móvil.
4. Desgasificador: A menudo incorporados en las bombas cuaternarias (o en sistemas isocráticos). La solubilidad de los gases del aire es muy sensible a las variaciones de presión y temperatura del disolvente. La presencia de aire puede provocar un aumento de la presión de la bomba y afectar la estabilidad del sistema.
5. Control de Temperatura (Opcional): Permite mantener la columna a una temperatura constante para optimizar la separación.
6. Precolumna: Situada entre la válvula de inyección y la columna principal. Su función es proteger la columna de componentes agresivos que pueda contener la muestra. Actúa como una primera barrera que soporta el impacto inicial de la presión y los contaminantes, evitando el deterioro de la columna analítica.
7. Detectores: La elección del detector depende de las características del analito a analizar.
   1. Espectrofotométricos: La celda de flujo por donde pasa la fase móvil funciona de manera similar a los espectrofotómetros convencionales.
   2. Fluorimétricos: Operan como un espectrómetro de emisión con celda de flujo.
   3. Refractométricos: Miden la variación del índice de refracción de la fase móvil cuando la muestra pasa a través de la celda.
   4. Conductimétricos: Miden la conductividad de la fase móvil.
   5. Espectrómetro de Masas: Proporciona información sobre la masa molecular y la estructura de los analitos.

4. Parámetros Fundamentales en Cromatografía

a) Parámetros Geométricos

Dependen del diseño físico del cromatógrafo y son independientes de las condiciones de trabajo y de la naturaleza de los solutos.

• VSS (Volumen del Soporte Sólido): Volumen ocupado por el material de soporte.
• VS (Volumen de la Fase Estacionaria): Volumen ocupado por la fase estacionaria líquida.
• VM (Volumen de la Fase Móvil): Volumen ocupado por la fase móvil en la columna.
• Vt (Volumen Total): Volumen total de la columna.
• L (Longitud de la Columna): Longitud física de la columna.

La relación entre estos volúmenes es: Vt = VS + VSS + VM

El Volumen Muerto (VM) es el volumen necesario de fase móvil para eluir un soluto que no es retenido por la fase estacionaria. Se mide utilizando un marcador, un compuesto químico que no es retenido por la columna (por ejemplo, uracilo para columnas C18).

b) Parámetros Operativos

Dependen de las condiciones de trabajo y son independientes de la naturaleza de los solutos.

• Tiempo Muerto (tM): Tiempo que necesita un soluto no retenido para atravesar la columna.
• Velocidad Promedio de la FM (u): Distancia avanzada del soluto por la fase móvil en una unidad de tiempo.
• Caudal de Flujo (F): Cociente entre el volumen de fase móvil y el tiempo que tarda este volumen en atravesar la columna.

c) Parámetros Característicos de los Solutos

• Volumen de Retención (Vr): Volumen de fase móvil necesario para eluir el soluto.
• Tiempo de Retención (Tr): Tiempo transcurrido desde la inyección hasta que se detecta la máxima concentración del soluto a la salida de la columna.
• Factor de Retención (k'): Es independiente de la columna y del caudal. Se calcula como: k' = (Tr - tM) / tM

5. Poder Separador y Eficacia Cromatográfica

a) Poder Separador de un Sistema Cromatográfico

Es muy importante medir el ensanchamiento de los picos cromatográficos; idealmente, deben ser estrechos para una buena separación.

b) Eficacia Cromatográfica

Este parámetro se basa en la teoría de los platos teóricos: el soluto, conforme avanza por la columna, permanece un determinado tiempo en cada uno de los platos, pasando de la fase móvil a la fase estacionaria y viceversa.

La eficacia se puede medir mediante:

• Altura Equivalente al Plato Teórico (H): Indica la eficiencia de la columna. Cuanto menor sea H, mayor será la eficacia.
• Eficacia Total del Sistema (N): Número de platos teóricos de la columna. Se calcula como: N = L / H

c) Resolución (Rs)

La resolución es el grado de separación entre dos solutos adyacentes. Se relaciona con el factor de selectividad (α).

• Si α = 1, no es posible separar el par de picos.
• Si α >> 1, los picos se separan fácilmente.