Cromatografia Líquida d'Alta Resolució i Tècniques Electroquímiques

La cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC) és una forma de cromatografia en columna a elevada pressió que possibilita la identificació i quantificació precisa de components en solucions. Aquesta tècnica, utilitzada en laboratoris clínics, és notablement sensible. Els eluents generen gradients de polaritat amb mescles polars i apolars. El cromatògraf HPLC consta d'una bomba de pressió (fins a 400 atm), sistema d'injecció per la mostra, columna amb fase estacionària, detector i sistema de registre de dades. En el laboratori clínic, s'aplica principalment per separar i quantificar l'hemoglobina glicada (HbA1c) per al control i diagnòstic de la diabetis, així com per fer seguiment de certs fàrmacs.Cromatografia d'adsorció: Basada en l'afinitat dels components per la fase estacionària segons la polaritat. Els components més afins es retenen més, sortint més tard, mentre que els menys afins sortiran abans. S'utilitza per separar ADN. Cromatografia d'adsorció en capa fina: Calcula el factor de retenció (Rf), essent més alt per a compostos apolars i més baix per als polars. Cromatografia de repartiment o d'exclusió molecular: Separa les substàncies per mida mitjançant una fase estacionària amb esferes microperforades. Les molècules més grans surten primer, amb temps de retenció més baix. Cromatografia d'intercanvi iònic: Separa els compostos segons la càrrega elèctrica. Columnes catiòniques retenen cations, mentre que columnes aniòniques retenen anions. Cromatografia d'afinitat: Utilitza unions específiques com Ag-Ac o enzim-substrat per separar substàncies. Es canvien les condicions per recuperar l'analit, com en test d'embaràs. Resolució en Cromatografia: La resolució en cromatografia es refereix a la separació entre els components. En la cromatografia plana, es busca la màxima separació de taques jugant amb la polaritat dels analits i de la fase mòbil. En cromatografia en columna, la resolució es defineix pel temps de retenció i l'amplada mitjana del pic. Més separació entre pics implica més resolució, facilitant la diferenciació dels components. Tècniques Electroquímiques: Les tècniques electroquímiques pertanyen a la química analítica, centrada en el moviment d'electrons en reaccions d'oxidació-reducció (redox). S'utilitza una cel·la electroquímica amb 2 elèctrodes, connectats a un circuit elèctric i un voltímetre. En el laboratori clínic, es destaquen dues tècniques: potenciometria i amperometria. Potenciometria: Mesura la diferència de potencial entre 2 elèctrodes. L'elèctrode indicador, sensible a la concentració de l'analit, i l'elèctrode de referència, amb un potencial constant i conegut, formen la cel·la electroquímica. Elèctrodes de Referència: Els elèctrodes de referència comuns són d'hidrogen (+0,000 V), mercuri (elèctrode de calomelans, +0,244 V) i Ag/AgCl (+0,197 V, conegut com a elèctrode de vidre, el més utilitzat). Elèctrodes Indicadors: Hi ha 2 tipus: metàl·lics i selectius d'ions (ISE). Els ISE tenen un potencial estàndard, i la diferència de potencial mesurada es relaciona amb la concentració d'ions segons E = Eº - 0,059 * log[ió]. Elèctrodes Selectius d'Ions (ISE): Inclouen un elèctrode de referència i un indicador, amb una membrana permeable als ions. S'utilitzen per mesurar ions com Na+, K+, Ca2+, H+, Cl-, NH3, HCO3, així com la pressió parcial de CO2 (pCO2). Útil per identificar malalties renals, pulmonars i cardíaques. Elèctrode de pH: Sensible a la concentració d'H+, amb una solució saturada d'HCl i KCl. La diferència de potencial mesurada és proporcional a la concentració d'H+ a la mostra segons E = Eº + 0,059 * pH. Elèctrode de CO2: És una variant de l'elèctrode de pH, amb una solució de NaHCO3 i NaCl. Mesura CO2 i genera H+ de manera proporcional a la quantitat de CO2, augmentant la diferència de potencial entre els elèctrodes. Utilitzat per a mesurar la pressió parcial de CO2. Amperometria: Aquesta tècnica es diferencia de l’anterior, perquè en aquest cas s’aplica un voltatge constant a l’elèctrode i es mesura si aquest varia, perquè es produeix una reacció química tipus redox. S’utilitza únicament per a la determinació de la pO2. Espectrometria de Masses (EM): És una tècnica sensible, ràpida i específica que identifica l'estructura molecular dels analits. Al laboratori clínic, s'utilitza per identificar compostos orgànics, tòxics, fàrmacs (com immunosupressors) o espècies bacterianes en fluids corporals. Procediment Bàsic: Volatilització i Ionització: La mostra es converteix en cations gasosos mitjançant ionització en una cambra específica. Acceleració dels Ions Positius: Els ions positius s'acceleren mitjançant un camp elèctric. Separació Segons Relació m/z: Utilitza diferents analitzadors, com massa quadrupolar o temps de vol (TOF), per separar els ions segons la seva relació massa/càrrega (m/z). Detecció dels Ions: Els ions impacten contra un detector que converteix la informació en una senyal elèctrica enregistrada. Tipus d'Ionització: Impacte d'Electrons (EI): Per mostres gasoses, molècules petites fins a 1 KDa. Ionització per Electrospray (ESI): Per mostres líquides, molècules fins a 200 KDa (pèptids). MALDI (Desorció/Ionització Assistida per Làser amb Matriu): Per mostres sòlides, molècules grans a partir de 500 KDa (proteïnes, DNA). Analitzadors Més Comuns: Massa Quadrupolar: Senzill. Temps de Vol (TOF): Més utilitzat en clínica. Resultats: Els resultats són espectres de masses que representen fragments moleculars segons la seva relació m/z i abundància. S'utilitza en combinacions com EI-Quadrupolar i MALDI-TOF. El software converteix la senyal en un gràfic, com en la determinació de proteïnes ribosomals de diferents espècies bacterianes. Per a una quantificació precisa, s'acopla l'espectròmetre de masses a equips com cromatografia de gasos, cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC), o electroforesi capil·lar. La separació inicial dels components es realitza amb HPLC o gasos, seguida de la quantificació mitjançant l'espectròmetre de masses. L'ionització es realitza amb fonts d'ionització a pressió atmosfèrica (API), com electrospray (ESI) o ionització química a pressió atmosfèrica (APCI), compatibles amb solvents volàtils usats com a fase mòbil en la cromatografia. Aquestes fonts d'ionització considerades toves produeixen fragments moleculars més grans i espectres més senzills. Els ions generats són accelerats cap a un analitzador i separats segons la seva relació m/z. ESPECTROMETRIA de MASSES MALDI-TOF: L'espectrometria de masses MALDI-TOF utilitza una matriu (MALDI), un làser UV de 337 nm com a font d'ionització i un analitzador de masses a temps de vol (TOF). Aquesta tècnica és emprada a la secció de Microbiologia per determinar l'empremta peptídica de microorganismes en mostres biològiques. Procediment: Seleccionar una colònia i transferir-la a la microplaca del MALDI-TOF. Cobrir el pou amb matriu orgànica reconstituïda i assecar. Introduir la placa a l'espectròmetre. Per fongs, micobacteris i plaques cromogèniques, cal una digestió prèvia amb àcid fòrmic. Per pellets d’hemocultius, es transfereix directament el pellet. Lectura de Resultats: El software indica el pou que està sent llegit i l'impacte del làser. L'aparell dispara el làser en diverses localitzacions del pou, obtenint diferents espectres (en blau) que conflueixen en un espectre definitiu (en vermell). Interpretació dels Resultats: El software compara l'espectre proteic amb la base de dades per identificar el microorganisme. Els resultats indiquen la fiabilitat de la identificació, amb marcadors de fiabilitat (VERD per gènere i espècie, GROC per gènere, RED per poca fiabilitat). Errors Possibles: Espectre de mala qualitat per errors com falta de matriu, massa o poca mostra, dipòsit inadequat, cristal·lització irregular o aïllament mucós. Espectre de bona qualitat amb resultats no esperats per contaminació, cultiu mixt o absència del microorganisme a la base de dades. Avantatges: Alt rendiment i baix cost de reactius. Poca quantitat de mostra necessària. Identificació de microorganismes difícils. Inconvenients: Alt cost de l'equip. Només identifica microorganismes presents a la base de dades i no els identifica si estan molt relacionats.