Cromatografía y Espectrometría de Masas: Principios y Técnicas Clave

Cromatografía: Principios y Técnicas Fundamentales

La cromatografía es una técnica esencial para la separación de mezclas complejas en sus componentes individuales. Se basa en la distribución diferencial de los analitos entre dos fases inmiscibles: una fase móvil y una fase estacionaria.

• Fase Móvil: Sustancia (gas o líquido) que arrastra los componentes de la muestra a través del sistema.
• Fase Estacionaria: Soporte fijo (sólido o líquido) con el que los componentes de la muestra interactúan de manera diferencial.
• Las sustancias se separan por su afinidad o interacción diferencial con las fases.
• El resultado de una separación cromatográfica es un cromatograma, una representación gráfica (generalmente con picos) que indica la presencia (qué) y la cantidad (cuánto) de cada componente.

Tipos de Cromatografía según la Interacción

La clasificación de las técnicas cromatográficas a menudo se basa en el mecanismo principal de interacción entre los analitos y la fase estacionaria:

• Adsorción: Basada en la polaridad. Los componentes se adhieren diferencialmente a la superficie de la fase estacionaria sólida.
• Reparto (Partición): Basada en la solubilidad diferencial de los componentes entre una fase estacionaria líquida y una fase móvil líquida. Se utiliza el valor Rf (factor de retardo).
• Intercambio Iónico: Basada en la carga eléctrica. Los iones de la muestra interactúan con resinas cargadas positiva o negativamente. Se emplean buffers para controlar el pH y la fuerza iónica.
• Exclusión Molecular: Basada en el tamaño de las moléculas. Las moléculas grandes eluyen primero porque no penetran en los poros de la fase estacionaria, mientras que las pequeñas quedan retenidas por más tiempo.
• Afinidad: Basada en la unión específica y reversible entre una molécula de la muestra y un ligando inmovilizado en la fase estacionaria (ejemplo: interacción Anticuerpo-Antígeno). La elución se logra con un cambio de pH o fuerza iónica.

Cromatografía en Capa Fina (TLC)

La Cromatografía en Capa Fina (TLC, por sus siglas en inglés, Thin Layer Chromatography) es una técnica de reparto líquido-líquido en la que también interviene un proceso de adsorción.

• La fase estacionaria es líquida y está unida a un gel (como sílice, celulosa o poliamidas) que se extiende sobre un soporte de vidrio o plástico en forma de capa fina de distintos grosores.
• La fase móvil fluye por capilaridad, generalmente de forma ascendente.
• Tras la elución, la placa se revela (si los compuestos no son visibles) y se miden las distancias recorridas por las distintas bandas o manchas.
• La relación entre las distancias recorridas por los componentes y la fase móvil desde el origen de la placa se conoce como Rf (factor de retardo), y tiene un valor constante para cada compuesto bajo condiciones cromatográficas concretas.

Cromatografía en Papel

En la cromatografía en papel, el agua retenida en las fibras de celulosa del papel actúa como fase estacionaria. La fase móvil es una mezcla de disolventes orgánicos acuosos.

• Aunque requiere tiempos largos y ya no se utiliza comúnmente en laboratorios de bioquímica modernos, su alto valor didáctico la mantiene como una práctica académica fundamental para estudiantes de química.

Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC)

La Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC, por sus siglas en inglés, High Performance Liquid Chromatography) es una técnica precisa y rápida, ampliamente utilizada para la separación, identificación y cuantificación de compuestos no volátiles o térmicamente inestables. Sus aplicaciones incluyen la separación de hormonas, fármacos y aminoácidos.

• Fase Móvil: Líquido (polar o apolar), impulsado a alta presión.
• Componentes principales:
  • Bomba: Impulsa la fase móvil a través del sistema.
  • Inyector: Introduce la muestra en la corriente de la fase móvil.
  • Columna: Donde ocurre la separación de los componentes de la muestra.
  • Detector: Mide los compuestos eluidos a medida que salen de la columna.
  • Colector y Registrador: Recogen las fracciones separadas y grafican el cromatograma resultante.

Cromatografía de Gases (GC)

La Cromatografía de Gases (GC, por sus siglas en inglés, Gas Chromatography) es una técnica de separación para compuestos volátiles o que pueden volatilizarse sin descomponerse.

• Fase Móvil: Gas inerte (como Helio o Nitrógeno), que actúa como gas portador.
• Fase Estacionaria: Líquido inmovilizado en el interior de una columna capilar o empaquetada.
• La muestra debe ser volátil o volatilizarse antes de la inyección en el sistema.
• La separación se basa en la solubilidad y difusión diferencial de los componentes en la fase estacionaria a diferentes temperaturas.
• Ofrece alta resolución y es ampliamente utilizada en campos como la toxicología, el control de calidad y el análisis ambiental.

Espectrometría de Masas (EM): Fundamentos y Componentes

La Espectrometría de Masas (EM) es una técnica analítica poderosa que mide la relación masa/carga (m/z) de iones para identificar compuestos, determinar estructuras moleculares y cuantificar sustancias. Es frecuentemente acoplada a técnicas cromatográficas para una identificación más robusta.

Fuentes de Ionización en Espectrometría de Masas

Las fuentes de ionización son cruciales para convertir las moléculas de la muestra en iones que puedan ser manipulados y detectados por el espectrómetro de masas.

MALDI (Ionización/Desorción Láser Asistida por Matriz)

• La muestra (analito) se mezcla con una matriz y se cristalizan conjuntamente sobre una placa.
• Un pulso de láser incide sobre la matriz, generando una nube de iones.
• La ionización ocurre principalmente por transferencia de protones entre la matriz y el analito.
• Un campo eléctrico guía los iones generados hacia el analizador de masas.

ESI (Electrospray Ionization)

• Una disolución de la muestra se bombea a través de un capilar a alto voltaje, generando un spray de gotas cargadas.
• Un gas caliente (generalmente nitrógeno) evapora el disolvente de las gotas.
• A medida que las gotas se encogen, la densidad de carga aumenta, provocando que los iones se repelan y sean liberados al vacío, dirigiéndose al analizador.

Analizadores de Masas

Los analizadores de masas separan los iones según su relación masa/carga (m/z) antes de que sean detectados.

Cuadrupolo

• Consiste en cuatro barras paralelas que crean un campo eléctrico oscilante (radiofrecuencia y voltaje DC).
• Actúa como un filtro secuencial, permitiendo el paso solo a iones con una relación m/z específica en un momento dado.
• Es robusto y versátil, comúnmente utilizado en sistemas GC-MS y LC-MS.

Tiempo de Vuelo (TOF)

• Todos los iones generados reciben la misma energía cinética.
• Los iones son acelerados a través de un tubo de vacío y su tiempo de llegada al detector se mide.
• Los iones más ligeros llegan antes al detector, mientras que los más pesados lo hacen después.
• Ofrece alta precisión en la determinación de masas y es ideal para acoplarse con fuentes de ionización pulsadas como MALDI.

Orbitrap

• Los iones son inyectados en un campo eléctrico electrostático donde giran y oscilan alrededor de un electrodo central.
• Cada ión oscila con una frecuencia característica que es inversamente proporcional a la raíz cuadrada de su relación m/z.
• Proporciona alta resolución y precisión de masa, lo que lo hace ideal para la identificación de estructuras moleculares complejas y el análisis de metabolómica y proteómica.