Clonación de ADN: Técnicas y Aplicaciones en Biología Molecular

Clonación de ADN: Técnicas y Aplicaciones

Introducción

La clonación de ADN es una técnica fundamental en biología molecular que permite la replicación de secuencias de ADN específicas. Este proceso implica la inserción de un fragmento de ADN exógeno en un vector, como un plásmido, para su posterior introducción en una célula huésped. A continuación, se detallan los mecanismos de transferencia genética bacteriana, la creación de librerías de ADN, los procesos de clonación, tipos de mutaciones, técnicas de análisis y aspectos de bioseguridad.

Mecanismos de Transferencia Genética Bacteriana

Transformación

La transformación es el proceso por el cual ciertas bacterias, llamadas competentes, incorporan ADN exógeno presente en el medio. Esta capacidad les permite captar, conservar e interactuar con el ADN extraño.

Transducción

La transducción es la transferencia de ADN de una bacteria a otra mediante un bacteriófago. Se distinguen dos tipos:

1. Transducción especializada: El genoma del bacteriófago integra información genética de la bacteria infectada previamente.
2. Transducción generalizada: Partículas virales defectuosas, originadas como cápsides vacías durante la replicación viral, incorporan ADN bacteriano. Al infectar una nueva bacteria, introducen este material genético.

Conjugación

La conjugación es el intercambio unidireccional de información genética desde una bacteria donante a una receptora mediante contacto directo.

Librería de ADN

Una librería de ADN es un conjunto de clones obtenidos a partir de los mensajeros de un tejido específico o de un órgano completo. El análisis secuencial y regulado de las poblaciones de mensajeros durante el desarrollo de un organismo también puede ser estudiado mediante ADN copia, sintetizado a partir de un mensajero y un cebador por la transcriptasa inversa.

Proceso de Clonación

La clonación es la introducción de material genético manipulado en una célula, de modo que se replique y transfiera a su descendencia. Los elementos clave son:

• ADN exógeno: El fragmento de ADN a clonar.
• Vector: Un plásmido, bacteriófago o cósmido que transporta el ADN exógeno.
• Enzimas: Enzimas de la célula huésped necesarias para la replicación.

Tipos de Mutaciones

Mutación silenciosa: Un codón se convierte en una señal de terminación, resultando en una proteína incompleta y no funcional.

Mutación supresora: Origina una proteína defectuosa, pero puede ser suprimida por una segunda mutación en otro sitio del genoma, restaurando el fenotipo original. Ejemplo: cat cat cat cat ccat.

Técnicas de Análisis

Técnica Southern

El ADN se digiere con enzimas de restricción, los fragmentos se separan por electroforesis en agarosa y se transfieren a un filtro de nitrocelulosa o nylon. La transferencia se realiza por capilaridad con un tampón de alta fuerza iónica. El ADN se fija al filtro mediante tratamiento a 80°C o irradiación UV. El filtro se hibrida con una sonda marcada en presencia de secuencias no complementarias para evitar uniones inespecíficas. Tras la hibridación, el filtro se lava con tampones de fuerza iónica decreciente para eliminar la sonda no hibridada.

Mutaciones Dirigidas en PCR

Se diseñan cebadores con desapariamientos puntuales respecto a la secuencia original, introduciendo mutaciones específicas. Esto permite estudiar la función de zonas concretas de una proteína.

Bioseguridad

• Falso: Las RBio son métodos seguros de manipulación de material biológico infeccioso para reducir o eliminar la exposición del trabajador y del medio ambiente.
• Falso: Los radioisótopos son químicos porque penetran en el organismo por inhalación o a través de la piel.
• Verdadero: Existen niveles de seguridad del 1 al 4.
• Falso: Los centros donde se manipulan radioisótopos se clasifican en 2, 0 o 3 categorías.
• Verdadero: Las vías de transmisión de agentes biológicos son respiratoria, ocular, digestiva, dérmica y parenteral.
• Verdadero: La gestión de residuos radiactivos y el plan de emergencia no se incluyen en el plan de protección radiológica, solo la manipulación y almacenamiento.
• Verdadero: La exposición a radiaciones no ionizantes incluye la UV.

Etapas de la Clonación

Inserción del ADN Exógeno en el Vector

Los vectores más empleados son plásmidos, bacteriófagos y cósmidos. Se utilizan moléculas circulares y pequeñas que pueden transportar genes de resistencia a antibióticos. Para la inserción, se emplean enzimas de restricción que cortan el ADN en lugares específicos. La electroforesis permite determinar los pesos moleculares de los fragmentos. Se requieren regiones complementarias para la unión del vector y el ADN exógeno. La ADN ligasa refuerza las uniones con enlaces covalentes.

Transformación

La transformación es la introducción del vector con el ADN exógeno en la célula viva. En E. coli, se suspende las células con el plásmido en soluciones hipotónicas de Cl₂Ca a 4°C.