Clonació Gènica i PCR: Tècniques Essencials en Biotecnologia

Procés de Clonació Gènica: Pas a Pas

La clonació gènica és un procés fonamental en biotecnologia que permet obtenir múltiples còpies d'un gen d'interès. A continuació, es detallen els seus passos principals:

1. Obtenció de l'ADN Donant

   • Extracció de l'ADN: Es realitza l'extracció completa de l'ADN d'una cèl·lula que posseeix el gen en què estem interessats.
   • Tall de l'ADN: Mitjançant l'ús d'enzims de restricció, es talla un tros de l'ADN que conté el gen desitjat. L'enzim de restricció tallarà una seqüència específica o una altra, depenent del tipus d'enzim utilitzat.

2. Unió del Gen a un Vector (Plasmidi Receptor)

   Els plasmidis receptors són molècules petites d'ADN extracromosòmic i circular que es repliquen de forma independent i contenen menys gens.

   • Obertura del Plasmidi: Mitjançant els enzims de restricció, se suprimeix una part del plasmidi, que restarà obert.
   • Inserció del Gen: En aquest buit s'insereix la porció d'ADN amb el gen o el gen com a tal. Fent ús de la lligasa, s'uneixen els fragments d'ADN.

3. Transformació Bacteriana (Tractament amb CaCl₂)

   L'ADN recombinant s'introdueix a la cèl·lula bacteriana receptora. Aquesta tècnica implica:

   • Preparació de Cèl·lules Competents: Cultivació i refredament de les cèl·lules.
   • Mescla amb CaCl₂: Les cèl·lules competents es mesclen amb CaCl₂. Això danya les membranes, permetent que les càrregues negatives de l'ADN interactuïn amb el Ca²⁺ de la membrana, neutralitzant-les i reduint la repulsió electrostàtica.
   • Addició del Plasmidi: El plasmidi s'afegeix al medi i traspassa la membrana amb facilitat.

4. Creixement i Selecció de Bacteris Recombinants

   Es deixa créixer el bacteri amb l'ADN recombinant, donant lloc a multitud de còpies del gen. No sempre aquest procés de transformació funciona completament, per la qual cosa s'han de seleccionar els clons que realment han adquirit el plasmidi.

   • Estratègia de Selecció: A més del gen que volem clonar, afegim un gen de resistència antibiòtica. Així, tots aquells bacteris que siguin resistents a l'antibiòtic tindran també el gen que volem clonar.
   • Cultiu Selectiu: Es cultiven aquests bacteris en un medi amb antibiòtic. Aquells que sobreviuen (són resistents) han incorporat el plasmidi, mentre que els que no, moren. D'aquesta manera, en un medi de cultiu només tenim aquelles cèl·lules amb el plasmidi (s'aïllen vectors recombinants).
   • Aïllament del Producte: Finalment, s'aïlla el producte del gen que es buscava amb aquest procés.

Eines Essencials per a la Clonació Gènica

Per dur a terme la clonació gènica, es requereixen diverses eines moleculars clau:

• Enzims de Restricció

  Són sistemes de defensa dels bacteris contra l'ADN estrany. Aquests enzims tallen l'ADN per una seqüència específica. Exemples: EcoRI, HindIII, BamHI.

• Vectors

  Són molècules d'ADN que transporten el gen d'interès a la cèl·lula hoste. Són principalment els plasmidis, però també poden ser bacteriòfags i virus eucariotes.

• Lligases

  Enzims que uneixen els fragments d'ADN. Exemple: T4 DNA lligasa, fosfatasa alcalina.

  Segons l'enzim de restricció utilitzat, els extrems que s'uneixen seran cohesius o roms:

  • Extrems Cohesius: S'enganxen mitjançant la complementarietat de les bases nitrogenades. Exemple: EcoRI.
  • Extrems Roms: És més difícil d'enganxar-los, ja que s'han d'unir dues cadenes independents. S'utilitzen com a última opció. De vegades, el gen es pot enganxar en sentit contrari.

Electroforesi: Separació de Molècules d'ADN

L'electroforesi és una tècnica utilitzada per separar molècules de material genètic (ADN, ARN) o proteïnes segons la seva mida i càrrega. Permet separar fragments tallats amb EcoRI d'un gen de la resta que no busquem clonar, així com el plasmidi del tros que eliminem.

1. Preparació del Gel

   Es prepara un gel d'agarosa (per ADN) o poliacrilamida (per proteïnes i ARN) i una solució tampó (medi líquid amb sals) per mantenir el pH constant. El gel actua com una malla que permetrà el pas dels fragments petits, però dificultarà el pas dels grans.

2. Càrrega de les Mostres

   Es col·loca cada mostra d'ADN en una cavitat del gel, juntament amb una solució estandarditzada que servirà com a marcador de mida. També s'afegeix bromur d'etidi, que ens permetrà observar les bandes del gel després d'aplicar llum UV.

3. Aplicació de Corrent Elèctric

   S'encén el dispositiu i s'espera fins a 1 hora fins que els fragments es vagin desplaçant a través del gel.

4. Anàlisi dels Resultats

   S'observen els resultats obtinguts i es comparen amb el marcador per mesurar la mida dels fragments. Pot passar que:

   • S'observi 1 banda: Tots els fragments de la solució tenen la mateixa mida, tot l'ADN ha migrat a la mateixa posició.
   • S'observin més d'1 banda: Indica fragments de diferents mides.

   El gruix de la banda indica la quantitat de material genètic present.

Reacció en Cadena de la Polimerasa (PCR): Amplificació d'ADN

La PCR és una tècnica molecular que permet amplificar una mostra molt petita d'ADN diana fins a obtenir milions de còpies. Per dur-la a terme, necessitem:

• Mostra d'ADN: L'ADN que es vol amplificar.
• Primers/Encebadors: Petites seqüències d'ADN complementàries a l'inici del gen d'interès, necessaris per iniciar la còpia.
• Desoxiribonucleòtids (dNTPs): Necessaris per a la síntesi de les noves cadenes.
• Taq Polimerasa (enzim): Una ADN polimerasa resistent a la calor (fins a 98°C).
• Termociclador: Una màquina amb capacitat d'elevar i baixar la temperatura ràpidament per realitzar els cicles.

Procés de la PCR

1. Desnaturalització

   Mitjançant l'escalfament a 95-96°C, es desnaturalitza l'ADN, és a dir, se separen les seves dues cadenes. Una d'aquestes cadenes servirà com a motlle per sintetitzar la nova.

2. Hibridació de l'Encebador (Annealing)

   Es disminueix la temperatura a 55°C i els encebadors s'uneixen específicament al final del material genètic que volem copiar mitjançant ponts d'hidrogen. Aquí comença la reacció de polimerització.

3. Elongació de l'ADN

   Es torna a augmentar la temperatura fins a 70°C. A partir dels encebadors, la Taq polimerasa afegeix els nucleòtids en sentit 5'-3', sintetitzant noves cadenes d'ADN. Quan arriba al final, para de polimeritzar.

Aquest cicle es repeteix entre 25 i 35 vegades fins a obtenir el grau d'amplificació desitjat. Tot el procés es realitza en una solució que conté la mostra d'ADN, sals, encebadors i dNTPs. La reacció es produeix per la col·lisió entre les molècules.

Tipus de PCR

• RT-PCR (Reverse Transcription PCR)

  En comptes de Taq polimerasa, s'utilitza una retrotranscriptasa que permet passar de fragments d'ARN a ADN. És útil per estudiar l'expressió gènica.

• qPCR (Quantitative PCR)

  Utilitza un sensor de fluorescència que permet determinar la quantitat d'ADN a la mostra segons la quantitat d'ADN amplificat. És ideal per a la quantificació precisa de l'ADN.