Citometría de Flujo: Fundamentos, Componentes y Aplicaciones

1. Fundamento de la Citometría de Flujo

La citometría de flujo es una técnica utilizada para analizar poblaciones celulares en suspensión. Su principal aplicación actual es la caracterización de las subpoblaciones de linfocitos. Esta técnica destaca por su alto poder resolutivo, permitiendo analizar grandes cantidades de células de manera multiparamétrica. Sin embargo, su principal limitación es que solo se puede aplicar a células en suspensión. La capacidad de separar células que ofrece esta técnica la hace ideal para estudios funcionales con diferentes poblaciones celulares.

2. Preparación de una Suspensión Celular

Las suspensiones celulares se pueden obtener mediante la disgregación de material fresco. En el caso de tejidos sólidos, se utilizan métodos mecánicos o enzimáticos. Estos últimos se basan en el uso de enzimas como tripsina, proteasas, colagenasas, hialuronidasas o una combinación de ellas. Es importante tener en cuenta que estos procedimientos pueden alterar las características celulares o los antígenos de membrana, y su eficacia varía según el tipo de tejido. Si se busca analizar el inmunofenotipo de la superficie celular, se deben emplear métodos que garanticen la integridad de los antígenos celulares. Existen diversos métodos para separar y enriquecer células, basados en sus características físicas, químicas y funcionales. Los más comunes se basan en el tamaño y la densidad celular, utilizando técnicas de centrifugación.

3. Componentes de un Citómetro de Flujo

Un citómetro de flujo se compone de los siguientes elementos:

3.1 Sistema Hidráulico

Este sistema transporta la suspensión celular a una velocidad constante y controlada a través de la cámara de flujo o zona de detección. En esta zona, las células o partículas son expuestas individualmente al haz de luz. Es crucial que la velocidad de inyección de la muestra sea constante. El sistema hidráulico consiste en un capilar por el que fluye un líquido isotónico a presión y velocidad constantes, creando un flujo laminar. La suspensión celular se introduce en este flujo a una presión ligeramente superior para asegurar su paso por la cámara de flujo.

3.2 Sistema de Iluminación

Este sistema genera el haz de luz, generalmente láser, que ilumina la muestra. La luz láser se compone de una mezcla de longitudes de onda específicas, determinadas por la energía emitida por los electrones al cambiar de nivel energético.

3.3 Sistema Óptico

A medida que las células o partículas atraviesan el haz de luz, este sistema enfoca la iluminación, detecta la luz dispersada y selecciona la fluorescencia emitida. El sistema óptico se encarga de:

• Recoger la fluorescencia emitida a 90 grados mediante lentes de alta apertura numérica.
• Captar la señal de luz dispersada a 90 grados utilizando las mismas lentes que para la fluorescencia y dirigirla a su detector específico mediante espejos. Esta señal proporciona información sobre la refractariedad y la estructura celular.
• Detectar la dispersión frontal de la luz (conocida como luz dispersante hacia delante) mediante un detector específico. Esta señal está relacionada con el tamaño celular.

Además de las lentes y detectores mencionados, el citómetro de flujo incorpora filtros para eliminar y separar la luz recogida.

3.4 Sistema Electrónico

Este sistema garantiza una iluminación de intensidad constante, detecta y amplifica la respuesta de las células o partículas en forma de pulso analógico. Además, transforma las señales a formato digital y controla el proceso de separación celular. Las células se desplazan en gotas individuales y con un marcaje que permite distinguir y separar las diferentes poblaciones. Cuando una célula atraviesa el rayo láser, se ilumina durante unos microsegundos y emite un pulso fluorescente. Existen dos tipos de detectores de luz:

• Fotomultiplicadores: detectan la señal de fluorescencia y la luz dispersada a 90 grados.
• Fotodetectores de diodo: detectan la dispersión frontal de la luz.

Los pulsos detectados por los fotodetectores se envían a un amplificador lineal o logarítmico.

3.5 Sistema de Adquisición y Análisis de Datos

Este sistema permite la adquisición multiparamétrica, el análisis en tiempo real de los datos y el análisis de las subpoblaciones seleccionadas. Tras procesar la señal, proporciona información estadística de los datos y la representa en forma de histogramas.

4. Panning para Linfocitos

El panning para linfocitos es una técnica de separación celular sencilla utilizada para fraccionar linfocitos T y B. Este método utiliza placas de plástico recubiertas con anticuerpos específicos que se unen selectivamente a los linfocitos. Se requiere el uso de placas sensibilizadas con anticuerpos específicos para los marcadores de superficie de las subpoblaciones que se desean separar. Los anticuerpos se unen de forma no covalente a la placa de plástico, a la que se añade la mezcla celular. Las células que expresen el receptor complementario en su superficie (antígeno-positivas) se unirán a los anticuerpos fijados a la placa, mientras que las células que no lo expresen (antígeno-negativas) podrán ser eliminadas mediante lavado.